DDC在MPTP/p诱导的进行性帕金森病模型小鼠中脑黑质中的表达变化研究
作者单位：南京中医药大学
学位级别：硕士
导师姓名：顾晓松
授予年度：2021年
学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100204[医学-神经病学] 10[医学]
摘 要：背景:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种以黑质致密部（substantia nigra pars compacta,SNc）多巴胺能神经元进行性丧失为特征的全球第二大神经退行性疾病。多巴胺能神经元的凋亡会导致脑内合成的多巴胺大量减少,从而致使机体出现一系列的运动和非运动障碍,对患者的生活质量造成严重影响。芳香族L-氨基酸脱羧酶（Dopa decarboxylase,DDC）作为多巴胺合成过程中重要的限速酶,在PD的发病和治疗中起着尤为重要的作用。目的:通过建立1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶/丙磺舒（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine/probenecid,MPTP/p）诱导的进行性帕金森病小鼠模型,探究、验证DDC在进行性PD模型小鼠中脑黑质中的动态表达变化,从而更加全面的了解帕金森病的致病机制,探索出临床诊断和治疗帕金森病更加快捷高效的方法。方法:1.选用12周龄C57BL/6J雄性小鼠,随机分为对照组和MPTP/p模型组,MPTP/p模型组小鼠按照100mg/kg的剂量腹腔注射丙磺舒溶液,半小时后按照25mg/kg的剂量腹腔注射MPTP,每3.5天注射一次,连续注射10次;对照组腹腔注射等体积的生理盐水。在造模过程中,我们选取造模前、造模第3、6、10次四个时间点分别对两组小鼠进行行为学检测（嗅觉和平衡木贯穿实验）,用以评价小鼠的运动与非运动功能变化。同时,利用Western blot检测两组小鼠黑质中TH蛋白的表达量变化,评估模型制备情况。2.根据实验前期对特定时间点（0、3、6、10次后）小鼠中脑黑质组织进行的转录组测序[1],我们利用生物信息学分析方法对模型组与对照组之间差异表达的基因（Differentially expressed genes,DEGs）进行趋势分析,筛选出在多巴胺合成与转运途径中起关键作用的DDC基因,结合其上下游差异基因的表达变化,GO和KEGG功能富集分析揭示DDC在PD模型中发挥作用的主要途径,并进一步利用STRING（https://***/）构建蛋白网络互作关系。最后我们基于已发表的小鼠黑质区单细胞转录组数据（DropViz,http://***/）,对这些基因所在的细胞群进行了定位。3.选取造模前、造模第3、6、10次4个时间点,分别获取对照组小鼠及MPTP/p模型组小鼠的中脑黑质组织,利用qRT-PCR技术检测不同时间点DDC在黑质中mRNA的表达变化。利用免疫荧光双标检测不同时间点两组小鼠TH和DDC在中脑黑质中的定位及表达变化,采用免疫组织化学染色检测不同时间点两组小鼠DDC在纹状体中的动态表达变化。结果:1.通过行为学结果分析显示,随着造模次数的增加,小鼠非运动和运动症状,即嗅觉和平衡协调能力均逐渐降低,且在造模3、6、10次后PD小鼠行为学指标显著性下降（p0.05）。2.蛋白免疫印迹结果显示,随着造模次数的增加,TH蛋白的表达量呈现逐渐下降趋势,且在造模10次后出现显著性差异（p0.05）,上述结果均表明MPTP/p诱导的进行性PD小鼠模型的成功建立。3.通过前期对小鼠中脑黑质测序结果中模型组与对照组之间差异表达的基因进一步挖掘,功能富集、蛋白互作网络分析发现,涉及多巴胺合成、转运、代谢相关的基因,如DDC、TH、DAT、VMAT2,表达变化趋势呈现先上调（造模3次）再逐渐下调（造模6、10次）。其中DDC作为多巴胺合成过程中重要的限速酶,与以上基因协同引起PD模型小鼠的神经退变过程。小鼠黑质区单细胞数据分析结果显示,Ddc主要分布在多巴胺能神经元中。4.通过qRT-PCR检测并验证PD模型小鼠中脑黑质中Ddc与正常组小鼠对比,在造模的6次和10次后出现了显著性的下降,该结果与前期测序结果基本一致。免疫荧光化学染色结果表明在黑质中DDC与TH主要表达于神经元的胞质和突起中,且二者之间存在共定位,在造模过程中,DDC与TH的阳性细胞数量均逐渐减少,且在造模的6次和10次后与对照组小鼠对比有显著性差异。5.免疫组织化学染色结果,表明在造模过程中,纹状体内DDC阳性信号逐渐减少,在造模的6次、10次后出现显著性差异。结论:1.建立了可靠的MPTP/p诱导的进行性帕金森病小鼠模型。2.通过qRT-PCR、免疫荧光染色对PD模型小鼠中脑黑质的DDC、TH表达验证,与测序变化趋势结果相符;免疫荧光染色和单细胞数据显示,DDC在小鼠中脑黑质中主要分布于多巴胺神经元中。3.通过免疫组织化学进一步验证DDC在纹状体的表达随造模次数增加逐渐减少。其通过黑质-纹状体通路最终影响多巴胺的合成转运,导致运动功能受损,是出现PD样症状的关键因素。4.DDC通过影响中脑多巴胺的合成、转运、代谢,与TH、DAT、VMAT2等协同参与PD模型小鼠的神经退变过程。
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