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柑橘大实蝇直肠转录组及直肠提取物分析

柑橘大实蝇直肠转录组及直肠提取物分析

作     者:周童 

作者单位:西南大学 

学位级别:硕士

导师姓名:肖伟

授予年度:2020年

学科分类:09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题:柑橘大实蝇 直肠转录组 直肠物质鉴定 

摘      要:柑橘大实蝇Bactrocera minax(Enderlein),是柑橘类的一种毁灭性害虫之一,幼虫在果实中直接取食果肉,造成果实腐烂、未熟先落。信息素可以高效、专一的引诱成虫,但柑橘大实蝇的性信息素组分目前尚未有鉴定。为了推进柑橘大实蝇信息素的研究,明确合成柑橘大实蝇信息素的相关基因和性信息素的组分,本实验首先通过转录组技术分析了柑橘大实蝇性成熟前后直肠中表达基因的差异,然后通过溶剂提取和质谱分析,获得直肠提取物并进行物质分析。本研究最终发现大实蝇雌雄虫15日龄直肠提取物中存在螺缩醛2-乙基-1,6-二氧杂螺[4.5]十烷,并在差异基因中发现与螺缩醛合成、转运相关的46条有全长序列的基因,具体结果如下:1.先通过3代转录组测序技术,对柑橘大实蝇(雌雄蛹,雌雄成虫)进行全长转录组测序,获得49.28Gb的clean data。进一步,分别对柑橘大实蝇雌雄虫性成熟前后的直肠进行转录组(2代)测序,共获得77.36 Gb Clean Data,各样品的Q30碱基百分比均在93.39%及以上,将各样品的Unigene与NR、Swissprot、GO、COG、KEGG等数据库进行比对,共有43251条Unigene得到功能注释。差异基因方面,15日龄雌虫直肠与1日龄直肠相比,发现471条上调基因,606条下调基因;而15日龄雄虫直肠与1日龄直肠相比,发现1063条基因上调,733条基因下调。2.首先解剖柑橘大实蝇1日龄和15日龄雌、雄虫的直肠,然后分别用正己烷和二氯甲烷进行提取,对提取物进行GC-MS检测,最后将每个样品的检测结果进行对比分析,结果显示:不同日龄雌虫直肠的正己烷提取物,15日龄与1日龄相比新增4种酯类、5种烃类和1种酰胺;而二氯甲烷提取物,15日龄则比1日龄新增加7种酯类、4种烃类和1种酸;另一边,雄虫直肠的正己烷提取物,15日龄与1日龄相比新增5种酯类、10种烃类、1种醇类和1种酰胺;而二氯甲烷提取物,15日龄则比1日龄新增加17种酯类、5种烃类、4种酮类、2种酸类、2种醇类以及2种其他类物质;正己烷提取的15日龄雌雄虫相同的物质有6种酯、8种烃、1种醇和1种酰胺,二氯甲烷提取的有8种酯、15种烃、1种酸、1种酰胺、1种酮和1种芳香烃。实蝇属昆虫的性信息素组分中多有1,7-二氧杂螺[5.5]十一烷,在大实蝇15日龄雌虫直肠正己烷、二氯甲烷以及雄虫直肠二氯甲烷提取物中都存在2-乙基-1,6-二氧杂螺[4.5]十烷,二者同为螺缩醛且结构相似。3.根据昆虫体内螺缩醛的合成途径上参与的酶,对雌雄虫直肠差异基因检索,分别在雌雄虫中找到12、34条有全长的基因。雌虫中的基因为1条Fatty acid synthase(15日龄与1日龄相比上调8.57倍)、1条Desaturase(上调27.88倍)、5条Fatty acyl-Co A reductase(上调884.31、6.77、5.16、4.52、2.99倍)、3条Cytochrome P450(上调30.23、2.72、2.34倍)、2条Odorant-binding protein(上调14.69、4.08倍);雄虫中的基因有4条Acetyl-Co A carboxylase(上调7.03、3.82、20.06、3.23倍)、2条Fatty acid synthase(上调7.01、3.88倍)、6条Desaturase(上调61.17、29.23、8.82、2.58、13.51、11.35倍)、6条Fatty acyl-Co A reductase(上调5.25、4.43、2.44、4.61、9.68、5.55倍)、13条Cytochrome P450(上调934.74、14.69、9.40、20.02、3.67、230.81、12.32、28.73、5.33、91.00、302.15倍以及2条为15日龄特有)、3条Odorant-binding protein(上调13.59、5.87、5.03倍)。本论文研究结果表明,通过转录组测序对柑橘大实蝇性成熟前后的直肠进行对比,雄虫中找到1063条上调基因,733条下调基因,雌虫中找到471条上调基因,606条下调基因。通过GC-MS对性成熟前后的直肠物质进行鉴定,发现在二氯甲烷提取的15日龄雌雄虫直肠和正己烷提取的15日龄雌虫直肠中都存在2-乙基-1,6-二氧杂螺[4.5]十烷。联系直肠转录组和直肠物质鉴定的结果,并结合螺缩醛的合成途径,分别在雌雄虫中找到12、34条有全长的差异基因。柑橘大实蝇雌雄15日龄直肠与1日龄直肠相比,均发现大量差异表达基因。同时,柑橘大实蝇雌雄15日龄直肠与1日龄直肠的溶剂提取物相比,也发现大量新增物质,其中有一类螺缩醛成分。而参与该类物质生物合成的多个基因(雌虫22条,雄虫76条),在15日

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