胆囊收缩素（CCK）调控草鱼摄食与生殖的作用机制研究
作者单位：华中农业大学
学位级别：硕士
导师姓名：呼光富
授予年度：2021年
摘 要：草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国内陆水域主要养殖的四大家鱼之一,其产量逐年增长。但是草鱼的性成熟时间很长,雌鱼一般需要4-5年才能达到性成熟,这严重制约了其人工繁殖和良种选育的进程。因此,揭示草鱼性成熟启动调控的分子机制,找出调节其性腺发育和性成熟启动的关键因子,在此基础上再通过基因工程技术定向编辑关键因子缩短草鱼性成熟周期,实现鱼类性成熟启动的人为可控,对草鱼育种具有重要意义。本研究发现作为饱感因子的胆囊收缩素(Cholecystokinin,CCK)不仅可以抑制草鱼摄食,而且能够显著诱导其垂体内促性腺激素(Gt H)的合成与分泌,预示CCK可能是整合鱼类摄食代谢与性成熟启动两套系统的偶联因子。基于此,本研究通过解析CCK在草鱼垂体中与摄食和生殖调控关键因子之间的关系,阐明其参与鱼类摄食调控和性成熟启动的作用机制。主要研究结果如下:1.利用草鱼基因组数据库和草鱼垂体转录组数据,对CCK及其受体序列进行分析并扫描它们在垂体中的功能。以草鱼为研究对象,本研究首先克隆获得了CCKs(CCK1和CCK2)及其受体CCK-Rs(CCK1Ra、CCK1Rb和CCK2R)的全长c DNA序列。通过序列比对发现CCK1和CCK2序列高度保守,仅CCK2成熟肽的第三个氨基酸由“亮氨酸突变成了“缬氨酸。此外,受体CCK1Ra和CCK1Rb的序列也高度保守,两者都是CCK1R的亚型。接着受体-配体选择性实验结果显示CCK1对CCK1Ra和CCK1Rb有更高的激活率,而对CCK2R的激活率则与CCK2相同。然后,组织表达分析结果显示,CCK-Rs在草鱼垂体中高表达,预示CCK在草鱼垂体中可能发挥重要作用。最后,通过转录组数据分析发现CCK能够显著上调草鱼垂体细胞中摄食相关基因神经介质B(Neuromedin-B,NMB)、可卡因和安菲他明调节转录物(Cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)、尾加压素1(Urotensin1,UTS1)、肾上腺髓质素(Adrenomedullin,ADM)、瘦素受体(leptin receptor,LEPR)和胆囊收缩素受体2(Cholecystokinin receptor 2,CCK2R)和生殖相关基因促卵泡激素β亚基(Follicle-stimulating hormone beta subunit,FSHβ)、抑制素B亚基a(Inhibinβa,INHBβa)和分泌颗粒素II(Secretogranin II,SN2)的表达。2.揭示CCK在草鱼摄食调控中的作用机制。本研究通过摄食实验,发现草鱼进食后能显著提高下丘脑内的CCK1和CCK2 m RNA表达量,同时草鱼血糖浓度也明显升高。接着,腹腔注射葡萄糖发现高血糖可以明显促进CCK m RNA的表达。然后,腹腔注射CCK,结果显示CCK能显著抑制草鱼摄食,并且诱导垂体中抑食基因Neuromedin-B、(NMB、CART、UTS1、ADM、LEPR和CCK2R)的表达。最后,药理学实验发现,CCK对六种抑食基因的诱导作用是以时间和剂量依赖的方式实现的。受体选择性和受体后信号通路实验结果表明,CCK1R和CCK2R介导了CCK对NMB、CART、UTS1、ADM、LEPR和CCK2R的调控作用,同时也激活了腺苷酸环化酶/蛋白激酶A(c AMP/PKA)通路、磷脂酶C/肌醇1,3,5-三磷酸/蛋白激酶C(PLC/IP3/PKC)通路和Ca/钙调蛋白/Ca M-依赖性蛋白激酶II(Ca/Ca M/Ca MK-II)通路。基于以上实验结果,我们可以发现摄食升高了鱼类血糖水平,而高水平的血糖又显著提高了下丘脑中CCK m RNA含量,进而诱导垂体中厌食肽的高表达来参与硬骨鱼类的摄食调节。3.阐明CCK调节草鱼垂体中生殖相关基因表达的作用机制。首先,腹腔注射CCK,显示垂体中FSHβ、LHβ、INHBβa和SN2四种生殖基因的表达量显著升高。接着,药理学实验显示CCK能够以时间和剂量依赖的方式诱导垂体细胞中FSHβ、INHBβa和SN2的m RNA表达,同时会抑制LHβ的m RNA表达。但是在低剂量或者短时间内,CCK的处理反而会促进垂体细胞中LHβ的m RNA表达。另外,WB和ELISA实验结果显示CCK可以诱导FSH和LH的蛋白分泌。然后,受体选择性和受体后信号通路实验结果表明,CCK可以通过激活垂体中CCK1R和CCK2R来参与对FSHβ、INHBβa、SN2和LHβ的调节作用,同时也激活了c AMP/PKA、PLC/IP3/PKC和Ca/Ca M/Ca MK-II三条通路。4.CCK介导鱼类摄食与生殖调控的作用机制。首先,摄食能够通过升高血糖促进下丘脑CCK水平高表达;接着,一方面,CCK能够下行到垂体通过促进抑食相关基因表达抑制摄食;另一方面,CCK还能够通过显著促进垂体中FSH的合成与分泌参与生殖调控。
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