黄连配伍厚朴调控溃疡性结肠炎肠道菌群的作用机制研究

作     者：李红燕 

作者单位：成都中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王建

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：黄连 厚朴 配伍 溃疡性结肠炎 肠道菌群 

摘      要：目的:探究黄连与厚朴1:1配伍对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠诱导溃疡性结肠炎(UC)的治疗作用以及对肠道菌群的调节作用,探明黄连配伍厚朴改善溃疡性结肠炎的生物学机制,阐明二者配伍“清热燥湿功效的科学内涵,为临床治疗溃疡性结肠炎提供科学依据。方法:(1)建模及活动指数评分:将健康成年雌雄兼用的SD大鼠随机分为空白组,模型组,阳性药组(柳氮磺胺吡啶),黄连2.00、1.00、0.50 g/kg组,厚朴2.00、1.00、0.50 g/kg组,黄连与厚朴1:1配伍4.00、2.00、1.00 g/kg组,造模前预给药1d后,用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(40 mg/kg)灌肠建立溃疡性结肠炎模型,其后给药1次/d,连续7d;每天记录大鼠体重、粪便性状以及粪便隐血情况,进行疾病活动指数(DAI)评分。(2)结肠组织及形态学观察:末次给药后,安乐处死大鼠取结肠组织,计算结肠水肿指数以及结肠重量长度比,进行结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分;采用苏木精-伊红(HE)染色法,光镜观察黄连配伍厚朴对模型大鼠的结肠组织形态学的影响。(3)粪便收集采样:收集基于药效实验优选的黄连2.00 g/kg、厚朴2.00 g/kg以及黄连配伍厚朴4.00 g/kg各组粪便样本,提取DNA信息,建立微生物16S r RNA基因克隆文库,并进行高通量测序和生物信息学分析。(4)网络药理学预测黄连配伍厚朴调控溃疡性结肠炎(UC)的有效成分及作用靶点:使用Cytoscape 3.7.1软件,绘制“药物-活性化学物质-疾病-作用靶点网络图,用Omic Share平台作图工具,构建维恩图,筛选药物调控疾病潜在重要靶点,并通过分子对接技术筛选出黄连配伍厚朴调控溃疡性结肠炎的主要有效物质与结合的较优靶点。(5)基于预测靶点验证机制:基于预测结果,采用免疫印迹(WB)法、免疫组织化学(IHC)法检测UC模型大鼠结肠组织中环氧合酶-2(COX-2)蛋白、一氧化氮合酶(i NOS)的表达水平;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测UC模型大鼠结肠组织中环氧合酶-2(COX-2)、紧密连接蛋白(Claudin5)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL 4)、转化生长因子β1(TGF-β1)m RNA的表达量。结果:(1)黄连配伍厚朴对UC模型大鼠的改善作用:(1)DAI评分的结果显示:黄连2.00 g/kg组,黄连配伍厚朴4.00、2.00 g/kg组均可显著降低UC模型大鼠DAI评分(P0.05)。(3)结肠水肿指数与结肠重量长度比的结果显示:黄连2.00 g/kg组,黄连配伍厚朴4.00 g/kg组可显著降低UC模型大鼠结肠水肿指数和结肠重量长度比(P0.05)。(4)结肠组织损伤评分的结果显示:单味黄连、厚朴以及二者1:1配伍的各剂量组均可极显著降低UC模型大鼠结肠组织病理损伤评分(P0.05)。(2)黄连配伍厚朴对UC模型大鼠肠道菌群的调节作用:肠道菌群测序结果显示,模型组中乳酸杆菌(Lactobacillus)以及双歧杆菌(Bifidobacterium)丰度显著降低(P0.01),大肠埃希氏菌-志贺氏菌(Escherichia-Shigella)、严格厌氧梭状芽孢杆菌(Clostridium＿sensu＿stricto＿1)丰度显著增加(P0.01);黄连2.00 g/kg组、黄连配伍厚朴4.00 g/kg组中阿克曼氏菌(Akkermansia)、布劳特氏菌(Blautia)等益生菌丰度显著增加(P0.01);厚朴2.00 g/kg组中异杆菌(Allobaculum)、拟普雷沃氏菌(Alloprevotella)等益生菌丰度明显增加(P0.05);而各给药组中大肠埃希氏菌-志贺氏菌(Escherichia-Shigella)、严格厌氧梭状芽孢杆菌(Clostridium＿sensu＿stricto＿1)等肠道致病菌丰度显著降低(P0.01)。(3)黄连配伍厚朴调控UC作用靶点以及机制预测结果:共筛选出黄连的潜在活性成分作用靶点179个,筛选厚朴的潜