三甲胺及其代谢物诱导人呼吸道细胞的协同毒性效应及代谢组学研究
作者单位：广东工业大学
学位级别：硕士
导师姓名：李桂英;安太成
授予年度：2021年
学科分类：07[理学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学]
摘 要：挥发性有机胺在大气环境中广泛存在,由于其具有嗅阈值低、排放强度大、反应活性高等特点,对生态环境和公众健康造成有害影响,因此是大气污染控制的重要污染物。三甲胺(Trimethylamine,TMA)作为各种来源排放最多、含量最丰富的典型有机胺,更容易以吸入暴露的方式危害人体健康,引发人体呼吸系统的不良反应和疾病。而呼吸道作为外源污染物产生化学毒性的主要靶向器官,其内含的丰富酶系使呼吸道具有代谢外源挥发性污染物的能力。在这个代谢作用下,污染物可能被解毒,更有可能被激活为毒性更强的代谢物,进而对人体呼吸系统造成更为严重的毒性损伤。尽管如此,目前关于挥发性有机胺对人体呼吸系统的毒性效应和机制方面的研究仍比较少,而且挥发性有机胺作用于呼吸道后产生的代谢中间产物和代谢机制也尚未被阐明。因此,本论文选取典型挥发性有机胺TMA作为目标暴露污染物,采用体外培养的人支气管上皮细胞16HBE作为暴露主体,开展了外源污染物TMA及其被鉴定的代谢产物诱导的人呼吸道细胞的体外协同毒性效应及代谢组学研究。主要研究内容和结果包括:(1)首先从细胞水平,研究了不同剂量的TMA暴露16HBE细胞不同时间后的急性毒性效应。结果显示,在10.15～91.35 m M的TMA浓度范围内,16HBE细胞活力呈现剂量依赖性下降,从94.66%±3.11%下降到5.88±1.48%,而细胞内活性氧物种(ROSs)的产生呈剂量依赖性上升,从27.25%±4.17%上升到154.82%±32.67%。ROSs的过量产生导致细胞机体内的氧化还原状态的失衡,进而诱导抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)的激活,而抑制过氧化氢酶(CAT)的表达。氧化应激程度的加剧进一步导致细胞促炎症因子白细胞介素-6(IL-6)的大量分泌,最高浓度可达到84.12±7.47 pg/m L,进而诱导16HBE细胞膜破损以及细胞坏死。(2)我们进一步研究了TMA在16HBE细胞中产生的代谢中间产物和代谢机制,探究了TMA及其代谢产物对16HBE细胞的毒性可能会产生协同效应。通过采用质子转移反应-飞行时间质谱(PTR-TOF-MS)和质子转移反应-四极杆质谱(PTR-QMS)对TMA及其挥发性中间产物进行实时定性和定量分析。此外,利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱联用技术(UPLC-QTOF-MS),将直接注射的非靶标检测方法与经丹磺酰氯衍生化的含胺代谢物的靶标检测方法相结合,对细胞和培养基中TMA的主要代谢产物进行了鉴定。研究发现,细胞顶空和培养基中TMA的含量减少,表明在细胞暴露期间TMA经历着一定程度的代谢消耗。此外,浓度增加的二甲胺(DMA)被认为是TMA关键的代谢产物。对TMA的代谢过程分析发现除了通过脱甲基的方式形成DMA和甲胺(MA)产物外,TMA还可能在细胞色素P450(CYP)酶的参与下通过N-甲酰化或羟基化作用氧化形成N,N-二甲基甲酰胺或N,N’-双(2-羟乙基)-1,2-乙二胺。这些鉴定出来的代谢物均比母体化合物TMA毒性更高,其中N,N-二甲基甲酰胺则更是被列为致癌物。因此,在TMA暴露期间,16HBE细胞可能产生更多的有毒代谢产物,这些代谢产物与有机胺母体化合物一起协同诱导细胞内的毒性效应。(3)最后,基于质谱的非靶向细胞代谢组学分析,探究了TMA暴露对16HBE细胞内代谢组扰动的潜在影响。结果显示,TMA诱导16HBE细胞代谢组的显著变化,火山图、主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)的统计学结果也表明了TMA对16HBE细胞代谢组的扰动变化具有剂量依赖性。此外,共有18种主要的内源性差异代谢物被筛选和鉴定。并且进一步确定了这些主要代谢物介导的5条主要代谢通路,包括鞘氨醇和鞘氨醇-1-磷酸代谢、精胺和亚精胺的生物合成与降解、氨基糖和核苷酸糖代谢、血清素降解、胆汁酸生物合成等。进一步分析发现,TMA诱导的代谢组变化可能与人体细胞凋亡、氧化应激的激活等毒理学效应,以及机体代谢紊乱、神经失常、肿瘤等疾病机制的产生密切相关。综上所述,本论文研究旨在揭示外源污染物TMA作用于人体呼吸道细胞16HBE后TMA可能的代谢途径及作用机制,同时结合细胞毒理学效应和代谢组学的研究,综合阐明了TMA及其代谢产物对人体呼吸道的潜在毒性机制。结果表明挥发性有机胺的暴露可以诱导呼吸道细胞产生更多的有毒代谢产物,这些代谢产物与有机胺母体化合物一起可能协同诱导细胞内的氧化损伤和坏死机制。此外,TMA诱导的呼吸道细胞内代谢组扰动可能与TMA引起的毒理学效应和疾病产生的细胞机制具有潜在的相关性。该研究为TMA及其代谢产物暴露介导的呼吸道协同毒性效应提供了有价值的见解,代谢组学研究的整合更是为TMA作用于人体呼吸系统后特定分子机制和主要代谢通路的确定提供了理论依据,这对研究挥发性有机胺的呼吸
同方学位论文库