抑制自噬促进二甲基塞来昔布（DMC）诱导鼻咽癌细胞凋亡的研究

作     者：付翔杰 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谭潭

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：DMC 鼻咽癌 凋亡 自噬 

摘      要：目的:鼻咽癌由于恶性程度较高、晚期患者居多、易出现复发和转移以及目前鼻咽癌的放/化疗治疗效果不容乐观,因此迫切需要寻找新型、可靠的鼻咽癌治疗方案。近年来,大量研究表明2,5-二甲基塞来昔布(DMC),作为塞来昔布的紧密衍生物,在许多肿瘤中有很好的抗肿瘤作用。但目前在鼻咽癌中尚未有报道。自噬在肿瘤治疗中是一把双刃剑,一方面能够诱导自噬性细胞死亡,而另一方面认为化疗或放疗自身诱导的自噬可以抑制肿瘤细胞凋亡。因此本研究旨在探讨DMC在鼻咽癌中是否有抗肿瘤作用以及探讨鼻咽癌中DMC对细胞凋亡以及自噬调节的影响。这将有助于DMC对鼻咽癌抗肿瘤治疗提供新型和更有效的策略。方法:1、细胞存活率检测:通过MTT检测不同浓度(0、20、40、60、80、100μM)的DMC处理CNE-2/CNE-2R细胞24h、48h、72h后细胞抑制情况;通过平板克隆检测不同浓度(0、20、40μM)的DMC处理后细胞存活情况。2、鼻咽癌瘤体抑制情况的检测:用肿瘤皮下种植瘤模型观察DMC(0、20、40mg/kg)处理后裸鼠皮下瘤体大小与重量变化情况。3、细胞凋亡检测:通过流式细胞术检测不同浓度(0、20、40μM)的DMC处理细胞24h后细胞凋亡情况以及检测control、DMC、CQ以及DMC+CQ处理组的细胞凋亡情况;通过免疫印迹法不同浓度(0、20、40μM)的DMC处理细胞24h后凋亡相关蛋白Bax、Bcl2、cleaved PARP、caspase3和cleaved caspase3水平的影响以及检测control、DMC、CQ和DMC+CQ处理组的Bax、Bcl2、cleaved PARP和survivin蛋白水平的影响。4、自噬小体产生的检测:通过免疫印迹法在体外和体内检测不同处理后LC3A/B、P62蛋白水平表达;以及免疫荧光技术检测不同处理后LC3A/B的荧光斑点数量变化。通过透射电子显微镜观察DMC处理后胞质双层酸性自噬囊泡的数量变化。5、自噬流的观察:m RFP-GFP-LC3腺病毒感染两株鼻咽癌细胞后,通过激光共聚焦观察不同处理后自噬流的情况。结果:1、MTT结果显示:DMC能有效的抑制CNE-2/CNE-2R细胞的增殖,并随浓度增加和时间的延长抑制更明显,具有统计学意义,两株细胞48h的IC50分别是43.71μM、49.24μM。平板克隆实验结果说明DMC处理后的克隆数明显少于未处理组(p0.05),具有统计学意义。2、体内实验显示:与未处理组相比,DMC处理后能显著减小肿瘤的大小、减少瘤体重量,并有浓度依赖性,具有统计学意义。3、流式凋亡结果显示:随DMC浓度的增加,细胞凋亡率也逐渐增加,具有统计学意义;相比单独DMC组和单独CQ组,DMC+CQ联合组的细胞凋亡率大大增加,具有统计学意义。免疫印迹法结果显示:随着DMC浓度的增加,Bcl2/Bax的比值下降,而cleaved PARP、caspase3和cleaved caspase3增加;相比单独DMC组和单独CQ组,DMC+CQ联合组的Bcl2/Bax的比值和survivin下降,cleaved PARP增加。4、免疫印迹法显示:DMC处理后细胞和动物水平上LC3A/B、P62蛋白表达均明显增加;3-MA能够抑制DMC增加的LC3A/B、P62表达水平,CQ能更进一步促进DMC上调的LC3A/B、P62表达水平。同样,免疫荧光结果显示:与未处理组相比,DMC处理后LC3A/B荧光斑点也逐渐显著增加(p0.05),并有时间依赖性;3-MA能够抑制DMC增加的LC3A/B荧光斑点数量,CQ能更进一步促进DMC上调的LC3A/B荧光斑点数量,具有统计学意义。5、透射电子显微镜观察DMC处理后胞质内出现大量双层酸性自噬囊泡。6、通过激光共聚焦观察发现m RFP-GFP-LC3腺病毒感染两株鼻咽癌细胞中DMC处理组和RAPA处理组的自噬流通量增强;CQ处理组的自噬流受阻;而DMC能够缓减CQ自噬流的受阻。结论:1、DMC能够抑制鼻咽癌增殖,诱导CNE-2/CNE-2R细胞凋亡。2、DMC能够诱导自噬增加自噬小体并促进自噬流。3、自噬抑制促进DMC诱导鼻咽癌细胞凋亡的作用。