岩藻糖基转移酶Ⅳ（FUT4）促进子宫内膜蜕膜过程的作用及机制研究

作     者：王雪吟 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘帅

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：子宫内膜蜕膜化 难免流产 FUT4 LeY PDK/AKT/GSK-3β 

摘      要：目的:在哺乳动物生殖过程中,子宫内膜蜕膜化是胚胎植入子宫内膜过程中,引起子宫内膜间质的广泛重构的过程。子宫内膜蜕膜化对于胚胎植入是非常重要的过程。子宫内膜蜕膜化异常可引起许多妊娠相关疾病,如不孕症、复发性流产、胎儿宫内生长受限、子痫前期、子宫内膜异位症等。蛋白质糖基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰方式,分为N-糖基化和O-糖基化。岩藻糖基化是一种重要的糖基化修饰方式,岩藻糖基化参与胚胎发育、肿瘤发生和免疫功能障碍等重要的生理及病理过程。岩藻糖基转移酶是催化岩藻糖基化的关键酶,分为N-盐藻糖基转移酶和O-岩藻糖基转移酶,催化岩藻糖基从核苷二磷酸岩藻糖转移到受体分子。N-岩藻糖基转移酶IV（fucosyltransferase 4,FUT4）催化岩藻糖（L-fucose）通过α-1,3糖苷键连接到H type 2[Fucα→1Galβ1→4Glc NAcβ1→R]抗原,生成LeY（Lewis antigen Y,LeY）[Fuc1→2Galβ1→4（Fuc1→3）Glc NAcβ1→R]。LeY是细胞表面Lewis寡糖,LeY在胚胎发育过程中呈阶段特异性表达,在着床窗口期胚胎表面高表达,参与胚胎植入过程。实验室前期研究表明,子宫内膜上皮细胞表面LeY介导胚胎和子宫内膜上皮的黏附作用,而在子宫基质细胞蜕膜化过程中的影响及机制研究还未见报道。方法:1.利用免疫组织化学实验检测FUT4/LeY/LTL在增生期、分泌期、正常早孕期及难免流产期的子宫内膜组织中的表达。2.体外诱导人子宫内膜基质细胞,利用Western blot、Real-time PCR及细胞免疫荧光实验检测蜕膜后蜕膜标志物、FUT4在基质细胞的表达。3.通过转染FUT4-si RNA和FUT4-c DNA调节h ESCs细胞中FUT4的表达,利用Western blot、Real-time PCR检测FUT4及蜕膜标志物的表达。4.通过转染FUT4-si RNA和FUT4-c DNA调节h ESCs细胞中FUT4的表达,利用Western blot、CCK8和细胞免疫荧光实验检测蜕膜后细胞增殖情况。5.通过pull down实验及质谱测定,筛选并确定LeY的靶蛋白CD47,通过免疫共沉淀实验检测蜕膜后,调控FUT4检测特定靶蛋白上LeY的变化,及其介导的信号通路的改变,对蜕膜过程的影响。结果:1.免疫组织化学检测人增生期、分泌期、孕早期及难免流产期组织中FUT4/LeY表达,结果显示:FUT4/LeY在增生期、分泌期、孕早期的表达依次增加,而在难免流产期的表达低于孕早期。2.体外诱导基质细胞蜕膜化后,细胞形态上体积变大,由梭形变成圆形,蜕膜标志物PRL和IGFBP-1表达增加,蜕膜后h ESCs细胞中FUT4表达增加。***4促进基质细胞蜕膜化。通过Western blot、Real-time PCR及细胞免疫荧光实验,结果显示:h ESCs细胞诱导蜕膜化同时,下调FUT4的表达,可以抑制蜕膜标志物PRL和IGFBP-1的表达。上调FUT4,促进PRL、IGFBP-1及FUT4的表达。***4通过激活细胞周期蛋白促进子宫内膜基质细胞的增殖能力。细胞免疫荧光结果显示,与对照组相比,在h ESCs细胞中转染FUT4-si RNA后,细胞增殖核抗原（PCNA）的表达降低;转染FUT4-c DNA后,PCNA的表达高于对照组。Western blot实验结果表明,与对照组相比,转染FUT4-si RNA,PCNA、CDK4和CDK6的表达降低;转染FUT4-c DNA,PCNA、CDK4和CDK6的表达增加。通过CCK-8实验结果发现,FUT4-si RNA抑制细胞增殖能力;FUT4-c DNA促进细胞增殖能力。***4通过上调LeY的表达激活PDK/AKT/GSK-3β信号通路从而促进子宫内膜蜕膜化。通过pull down实验的结果,并进行质谱分析。质谱结果筛选到,在正常早孕相比难免流产中有显著差异表达的蛋白有233个。进一步从GO功能中筛选出靶蛋白CD47。通过免疫共沉淀实验检测,与对照组相比,转染FUT4-si RNA,CD47上的LeY表达降低,p-PDK、p-AKT、和p-GSK-3β的信号通路受到抑制,抑制蜕膜;转染FUT4-c DNA,与对照组相比,CD47上的LeY表达增加,p-AKT、p-PDK和p-GSK-3β信号通路被激活,促进蜕膜。加入通路抑制剂LY294002后,蜕膜标志物PRL和IGFBP-1的表达降低。结论:1.与孕早期相比较,FUT4/LeY在难免流产患者组织中表达降低。***4增加CD47上LeY的合成,激活PDK/AKT/GSK-3β信号通路,促进子宫基质蜕膜化。