利用酵母双杂交系统筛选与甘蔗条纹花叶病毒VPg互作的寄主因子

作     者：翟玉山 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：林彦铨;徐景升

授予年度：2016年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：甘蔗条纹花叶病毒 VPg 转录延伸因子C亚基 酵母双杂交系统 Real-time qPCR 

摘      要：甘蔗(Saccharum ***)是我国乃至世界最重要的糖料作物,同时也是重要的能源作物。在甘蔗生产上,甘蔗花叶病(sugarcane mosaic disease,SMD)在世界各蔗区普遍发生,是危害最为严重的病毒性病害之一,严重影响甘蔗的产量和品质。SMD的病原主要是甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV),三者同属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae),但与SCMV、SrMV属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)不同,SCSMV属于禾本科病毒属(Poacevirus)。目前,研究SMD发病机制的报道尚少,尤其是关于SCSMV侵染的分子机制研究尚属空白。本研究通过构建感染SCSMV的甘蔗叶片的酵母双杂交cDNA文库,以SCSMV-VPg蛋白为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选出与其互作的寄主因子。同时,挑出与之互作的甘蔗转录延伸因子C亚基(Elongin C,ELC)重点研究,初步探索了 ScELC在SCSMV侵染过程中的作用。研究结果如下:(1)利用Gateway技术构建了感染SCSMV的甘蔗叶片cDNA文库,为筛选与SCSMV互作的甘蔗寄主因子,研究甘蔗与SCSMV的互作机制及甘蔗抗花叶病育种奠定了基础。(2)利用PCR技术克隆了 SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,成功构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Hc-Pro、pGBKT7-P3N-PIPO、pGBKT7-CP和pGBKT7-VPg,且重组质粒对酵母菌株Y2HGold无自激活活性及毒性作用,适用于甘蔗酵母cDNA文库的筛选。(3)以SCSMV-VPg蛋白为诱饵,利用酵母双杂交系统(yeasttwo-hybrid system,Y2HS)筛选甘蔗cDNA文库,初步获得阳性克隆子9个,生物信息学分析显示,这些基因分别参与了转录调控、基础代谢、光合作用和胁迫防御等生物学过程。(4)挑选候选阳性克隆ScELC重点研究。利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)和双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)证明了 ScELC与SCSMV、SCMV、SrMV的VPg均存在互作关系。ScELC基因的组织表达特异性分析表明,ScELC基因在苗期和成熟期甘蔗的各组织中均有表达,其分别在苗期甘蔗的叶片和成熟期甘蔗的根中表达量最高。ScELC蛋白的亚细胞定位实验显示,ScELC蛋白定位于细胞质和细胞核中。为研究ScELC在SCSMV侵染过程中可能发挥的作用,利用Real-time qPCR技术分析了 SCSMV侵染对ScELC基因表达的影响,并对ScELC和甘蔗翻译起始因子eIF4E(SceIF4E1、SceIF4E2和SceIF4E3)的互作关系进行了研究。结果显示,接种SCSMV后,ScELC基因的表达量明显上调。Y2H和BiFC的结果表明,ScELC仅与SceIF4E2之间存在互作关系,说明ScELC和SceIF4E2在SCSMV侵染过程中可能具有一定的关联。