酿酒酵母异源合成蒲公英赛醇的研究

作     者：谭锦秀 

作者单位：天津大学 

学位级别：硕士

导师姓名：卢文玉;墨玉欣

授予年度：2020年

学科分类：081703[工学-生物化工] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：蒲公英赛醇 酿酒酵母 萜类化合物 合成生物学 

摘      要：蒲公英赛醇是一种齐墩果烷型五环三萜类化合物,具有良好的抗炎症、抗肿瘤、抗氧化作用,在治疗糖尿病、保肝等方面也有很好的效果。目前主要通过从植物中萃取获得蒲公英赛醇,鲜少有采用化学合成法或生物合成法合成蒲公英赛醇的研究。酿酒酵母是常用的模式微生物,本文以酿酒酵母W303为出发菌株,将两种不同来源的蒲公英赛醇合酶基因经密码子优化后分别导入其中,结合ERG1基因的过表达,构建出了能够生产蒲公英赛醇的工程菌WKd E2,产量为1.85mg/L;然后通过过表达蒲公英赛醇生物合成途径中的关键基因t HMG1、ERG20、ERG9,使蒲公英赛醇的产量提高至17.02mg/L;接着通过敲除GAL80基因对酿酒酵母的GAL调控系统进行了改造,构建出的工程菌WTK15蒲公英赛醇产量虽下降至12.51mg/L,但发酵过程中无需再添加诱导剂半乳糖,极大降低了发酵成本;然后再利用HXT1p启动子下调ERG7的表达来控制竞争通路中甾醇的合成,结果发现蒲公英赛醇产量不升反降。对菌株WTK15进行内质网改造,首先用PGK1p启动子与ADH2p启动子分别过表达能够激活磷脂合成的基因INO2,构建出的菌株WTK17与WTK18蒲公英赛醇产量分别为16.12 mg/L、14.80 mg/L,分别提高至WTK15的1.29倍、1.18倍;继续敲除WTK17中的OPI1基因,所得菌株WTK19蒲公英赛醇产量进一步提高至17.35mg/L。摇瓶发酵优化后进行5L罐放大培养,批次发酵蒲公英赛醇产量最高为25.79 mg/L,在以乙醇为补料碳源进行补料发酵时产量最高提升至59.55mg/L。