凡德他尼诱发皮肤毒性的作用机制与干预策略研究

作     者：沈晓飞 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：罗沛华

授予年度：2022年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：细胞凋亡 自噬 双去甲氧基姜黄素 皮肤毒性 凡德他尼 

摘      要：目的:凡德他尼是由阿斯利康公司研发的一种多靶点小分子激酶抑制剂（Small Molecule tyrosine Kinase Inhibitor,SMKI）,主要抑制血管内皮生长因子受体1,2,3（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,VEGFR-1,2,3）、表皮生长因子受体（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,EGFR）和转染重排（Rearranged during Transfection,RET）等各种类型受体,临床主要用于治疗不可切除的甲状腺髓样癌（Medullary Thyroid Carcinoma,MTC）。凡德他尼治疗期间出现严重的皮肤不良反应限制了其临床的长期使用,各类皮肤毒性的发生率为29.2%～71.2%,极大地影响了患者的生活质量,甚至会影响药物的治疗效果,进而缩短患者的存活时间。目前,临床上凡德他尼引起的皮肤不良反应因为机制研究的匮乏,而缺乏有效的应对手段。本论文着力于研究凡德他尼引起的皮肤毒性,并明确潜在的毒性机制,以制定干预策略,以期为临床医生提供行之有效的联合治疗选择。方法:以C57BL/6J小鼠和人角质形成细胞（HaCaT）、人原代角质形成细胞（NHEK）为研究对象,在体内外水平考察凡德他尼引起的皮肤毒性。（1）给予C57BL/6J小鼠55 mg/kg/d凡德他尼,每天灌胃给药1次,连续给药21天,观察小鼠下巴、面部、腋下等部位的皮肤变化情况。（2）收取小鼠下巴、面部、腋下等部位的皮肤组织,采用HE染色,结合光学显微镜观察,定量小鼠皮肤角质层厚度变化情况。（3）收取小鼠下巴、面部、腋下等部位的皮肤组织,采用免疫组化检测皮肤组织中的增殖标记物Ki-67表达水平。（4）利用SRB法检测凡德他尼对HaCaT细胞和NHEK细胞增殖能力的影响,并计算细胞生存率（%）,同时在光学显微镜下观察凡德他尼作用下HaCaT细胞数量变化情况。以C57BL/6J小鼠和HaCaT细胞为研究对象,在体内外水平考察凡德他尼引起角质形成细胞死亡的方式以及具体途径。（1）采用上述C57BL/6J小鼠模型的皮肤组织样本,采用TUNEL法检测凡德他尼作用后角质形成细胞凋亡发生情况。（2）利用Western Blotting检测HaCaT细胞中凋亡相关蛋白c-PARP、c-Caspase 3、Bax、Bcl2、MCL1、Cyto C的蛋白表达水平。（3）采用PI/Annexin V双染法,结合流式细胞仪检测不同浓度（0、2.5、5和10μM）凡德他尼作用不同时间（0、12、24和48 h）后的HaCaT细胞凋亡情况。（4）采用泛Caspase凋亡抑制剂Z-VAD-FMK与凡德他尼联合作用于HaCaT细胞,利用Western Blotting和PI/Annexin V双染法结合流式细胞术测定Z-VAD-FMK和凡德他尼联用后,HaCaT细胞中凋亡相关蛋白表达水平和凋亡率（%）的变化情况。（5）采用HaCaT细胞模型,给予凡德他尼作用后,通过JC-1染色法检测线粒体膜电位（Mitochondrial Membrane Potential,MMP）的变化情况。（6）采用HaCaT细胞模型,给予凡德他尼作用后,通过MitoSOX探针染色,结合荧光共聚焦显微镜检测线粒体活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）的变化情况。（7）采用HaCaT细胞模型,给予凡德他尼作用后,结合免疫荧光观察γ-H2A.X核聚集情况,以及通过单细胞凝胶电泳实验检测DNA损伤程度。（8）采用HaCaT细胞模型,给予凡德他尼作用后,利用Western Blotting检测自噬标志物LC3和p62的表达水平变化,以及结合免疫荧光观察LC3蛋白聚集物的变化情况,考察凡德他尼作用后,HaCaT细胞中自噬的激活情况。（9）采用不同的自噬抑制剂CQ、Baf A1或3-MA与凡德他尼联用,通过Western Blotting检测凋亡标志物c-PARP和c-Caspase 3表达水平,并采用PI/Annexin V双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡发生情况,从而进一步确定自噬发生与凡德他尼引起的角质形成细胞凋亡的关系。以HaCaT细胞和C57BL/6J小鼠为研究对象,在体内外水平考察自噬激活剂双去甲氧基姜黄素（Bisdemethoxycurcumin,BDMC）对凡德他尼皮肤毒性的干预作用。（1）采用HaCaT细胞模型,给予BDMC作用后,利用Western Blotting检测自噬标志物LC3的表达水平变化。（2）采用HaCaT细胞模型,给予BDMC与凡德他尼联合作用后,Western Blotting检测细胞内c-PARP和c-Caspase 3表达水平;并采用PI/Annexin V双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡情况。（3）采用C57BL/6J小鼠为研究对象,分别每天灌胃给予50 mg/kg BDMC,55 mg/kg凡德他尼,50 mg/kg BDMC+55 mg/kg凡德他尼,连续给药21天,在体内模型上验证BDMC对凡德他尼皮肤毒性的干预作用。（4）收取小鼠下巴、面部、腋下等部位的皮肤组织,采用HE染色,结合光学显微镜观察,定量BDMC干预后小鼠皮肤角质层厚度变化情况。（5）收取小鼠下巴、面部、腋下等部位的皮肤组织,采用免疫组化检测BDMC干预后皮肤组织中的增殖标记物Ki-67表达水平变化情况。（6）采用上述C57BL/6J小鼠模型的皮肤组织样本,采用TUNEL法检测BDMC干预后角质形成细胞凋亡的发生情况。结果:以C57BL/6J小鼠和HaCaT细胞、NHEK细胞为研究对象,在体内外水平凡德他尼引起的皮肤毒性。给予55 mg/kg/d凡德他尼,可诱发C57BL/6J小鼠下巴、面部、腋下等部位皮疹。光学显微镜观察,测量小鼠皮肤角质层厚度,与溶媒对照组（19.9±4.6μm）相比,凡德他尼给药组（4.4±1.2μm）皮肤角质层厚度显著变薄（p0.001）。免疫组化检测发现,小鼠皮肤组织中的增殖标记物Ki-67表达水平明显降低。利用SRB法检测发现,随着凡德他尼浓度不断升高,作用时间延长,HaCaT细胞和NHEK细胞的细胞存活率（%）依次下降,并呈时间和浓度依赖关系;在光学显微镜下观察,HaCaT细胞数量依次减少。在体内外水平凡德他尼诱导角质形成细胞发生Caspase通路依赖的凋亡,并诱导自噬。通过TUNEL凋亡实验,在凡德他尼作用后小鼠角质形成细胞中观察到DNA片段。利用Western Blotting检测发现,HaCaT细胞中凋亡标志蛋白c-PARP、c-Caspase 3、Bax、Cyto C表达水平上调,抗凋亡标志蛋白Bcl2、MCL1表达水平下调。通过PI/Annexin V双染法结合流式细胞术发现,随着凡德他尼作用浓度增大、作用时间延长,HaCaT细胞凋亡率（%）依次升高,呈明显的浓度和时间依赖性。通过Western Blotting法发现,联用Z-VAD-FMK后HaCaT细胞中的c-PARP和c-Caspase 3的表达水平显著降低;通过PI/Annexin V双染法结合流式细胞术也发现,联用Z-VAD-FMK后HaCaT凋亡细胞数量明显减少。通过JC-1染色法检测发现,凡德他尼降低HaCaT细胞中MMP。HaCaT细胞经凡德他尼作用后,通过MitoSOX发现ROS水平升高。通过单细胞凝胶电泳试验发现,凡德他尼作用后,DNA碎片拖尾延长,尾部DNA百分含量（Tail DNA%）显著升高;免疫荧光检测发现,凡德他尼可促使DNA双链断链损伤的标志物γ-H2A.X表达水平升高;通过DAPI染色,凡德他尼作用后的HaCaT细胞核显示出DNA片段化和核固缩加剧的现象。HaCaT细胞经凡德他尼作用后,通过Western Blotting检测,自噬标志物LC3表达水平上调,呈浓度和时间依赖性。免疫荧光检测发现,凡德他尼作用后HaCaT细胞和NHEK细胞中自噬标记物LC3出现明显的点状聚集;自噬抑制剂CQ、Baf A1或3-MA与凡德他尼联用后,通过Western Blotting检测发现c-PARP和c-Caspase3明显上调;采用流式细胞术发现,联用自噬抑制剂后凋亡率（%）进一步升高。以HaCaT细胞和C57BL/6J小鼠为研究对象,在体内外水平自噬激活剂BDMC可减轻凡德他尼引起的皮肤毒性。通过Western Blotting检测,BDMC促进HaCaT细胞内LC3表达水平升高,表明BDMC具有自噬激活作用;Western Blotting测定,与单用凡德他尼相比,联用BDMC后HaCaT细胞c-PARP和c-Caspase 3的表达水平下降;采用PI/Annexin V双染法结合流式细胞术检测,与单用凡德他尼相比,联用BDMC后的HaCaT细胞凋亡率（%）有所下降。采用C57BL/6J小鼠为研究对象,分别每天灌胃给予50 mg/kg BDMC,55 mg/kg凡德他尼,50 mg/kg BDMC+55 mg/kg凡德他尼,连续给药21天,与单用凡德他尼相比,BDMC组小鼠下巴、面部、腋下等部位的皮疹明显减轻;测量皮肤角质层厚度:溶媒对照组、凡德他尼组、BDMC组、凡德他尼和BDMC联用组分别为:21.3±5.8μm、4.2±1.4μm、20.1±4.2μm和16.3±3.4μm;给予BDMC后,小鼠角质细胞中增殖标记物Ki-67明显增加;通过TUNEL法检测发现,联用BDMC后角质形成细胞中断裂的DNA片段减少。结论:本研究以C57BL/6J小鼠为体内模型,以HaCaT细胞和NHEK细胞为体外模型,研究凡德他尼诱导皮肤毒性的潜在机制。首先发现并明确了凡德他尼引起角质形成细胞发生Caspase依赖的凋亡,同时伴随着线粒体ROS的大量产生,以及DNA发生损伤,进一步研究表明凡德他尼可以诱导角质形成细胞发生自噬,并且自噬抑制剂联用可以加重凡德他尼引起的角质形成细胞凋亡。最后,本研究确定了天然药物BDMC可以激活角质形成细胞发生自噬,从而有效干预凡德他尼皮肤毒性。本课题的开展为治疗凡德他尼引起的皮肤毒性提供了有前景的治疗策略。