西瓜食酸菌抗铜基因类cusABC和类zneB的功能分析

作     者：宋金迪 

作者单位：新疆农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘君

授予年度：2021年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：西瓜食酸菌 转录组 相对表达量 抗铜性 功能鉴定 

摘      要：西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)是瓜类细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch,BFB)的病原菌,对全球葫芦科作物造成严重威胁。目前主要采用含铜的化学药剂进行杀菌抑菌,长期使用增加了该菌的铜耐受能力,从而使含铜杀菌抑菌剂对BFB病的防治效果不佳。为探究该菌的抗铜机制,本研究利用同源重组技术获得4个对铜敏感的突变菌株FC440(?cusA)、FC440(?cusB)、FC440(?cusC)、FC440(?zneB),分别构建相应的功能互补菌株,并分析相关生物学特性和相关基因的表达量;利用RNA-Seq技术对铜胁迫下的FC440进行转录组水平分析。验证结果如下:(1)对类CusA的研究发现:类CusA蛋白在结构上具有保守的ACR—tran结构域理化性质、互作模式等方面与大肠杆菌类似。与FC440野生菌株相比,FC440(?cusA)在铜胁迫培养基中生长能力减弱,在构建功能互补菌株FC440(?cusA-cusA)恢复。突变体FC440(?cusA)与野生型相比游动性减弱,在基因功能互补后恢复。该基因的功能缺失突变使菌株的致病性增强,未影响其它生物学特性。荧光定量PCR结果显示,FC440(?cusA)中的致病性相关基因hrc N和游动性相关基因fli C发生下调表达。(2)对类CusB的研究发现:膜融合蛋白类CusB具有Hlyd-D23结构域,理化性质等方面和大肠杆菌CusB相似。突变体FC440(?cusB)在铜胁迫培养基中生长能力明显减弱。FC440(?cusB)的纤维素酶分泌能力低于野生型。FC440(?cusB)与野生型相比致病表型增强。类cusB的突变,未改变其它生物学特性。荧光定量PCR结果显示,FC440(?cusB)中的类cusA发生下调表达,类cusC和fli C发生上调表达。(3)对类CusC的研究发现:类CusC保守的OEP外膜外排蛋白结构,理化性质等方面与模式菌株大肠杆菌相似。在类cusC突变后菌株在铜胁迫培养基的生长能力减弱,基因功能互补构建完成后恢复与野生型菌株一致。类cusC功能的缺失未影响到其它生物学特性。荧光定量结果显示,类cusC突变体中抗铜基因类zneB和鞭毛基因fli C下调表达。(4)对类Zne B的研究发现:类Zne B具有Hly D-23的结构域,理化性质等方面与贪铜耐受菌相似。西瓜食酸菌在Cu和Zn分别胁迫下,生长能力较野生型均减弱。类zneB突变体比野生型游动能力弱,胞外纤维素酶分泌增多,致病能力增强,而与其它生物学特性无关。荧光定量PCR结果显示,FC440(ΔzneB)中鞭毛基因fli C下调表达,类cusC上调表达。(5)对铜胁迫下的转录组数据分析显示:差异表达的基因显著富集于ABC转运系统的跨膜转运、双组分系统通路的信号转导以及氨基酸代谢等约9大通路;q PCR分析结果反映出基因表达趋势与转录组测序数据的趋势一致。以上结果表明,类cusA、类cusB、类cusC、类zneB参与了西瓜食酸菌的抗铜能力,其中类zneB还与锌抗性有关,但这些基因与西瓜食酸菌的胞外多糖、胞外蛋白酶、诱导过敏性坏死反应、生物膜形成能力无关,其中类cusA和类zneB与游动性呈正相关,类cusB、类zneB与胞外分泌活性有关。q PCR显示以上这四个基因均可影响鞭毛基因fli C的表达,说明这些基因与fli C的关系密切,此外,在FC440(?cusA)中q PCR表明致病性相关基因hrc N与类cusA关系密切,FC440(?cusB)中q PCR表明类cusA和类cusC与类cusB紧密相关。铜胁迫下谷氨酸、谷胱甘肽等的氨基酸代谢在西瓜食酸菌抗铜胁迫中发挥重要作用;双组分系统参与西瓜食酸菌对铜离子胁迫的响应且受到负调控;该菌中可能存在包含ABC转运体的跨膜转运、氧化还原反应、胞内束缚沉淀等多种系统互作的抗铜机制。本研究结果为进一步解析西瓜食酸菌的铜耐受分子机制奠定了基础,也为BFB病防治提供了参考依据。