HnERF1调控天仙子托品烷生物碱生物合成的研究

作     者：郑越月 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：廖志华;杨春贤

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：天仙子 AP2/ERF转录因子 调控 托品烷生物碱 生物合成 

摘      要：托品烷生物碱（Tropane Alkaloids,TAs）是一类抗胆碱药物,其代表性化合物有莨菪碱（Hyoscyamine）和东莨菪碱（Scopolamine）,在临床上广泛应用于麻醉镇痛、抗痉挛、止咳平喘、治疗晕动症和帕金森症等,市场需求巨大。天仙子（Hyoscyamus niger）是茄科天仙子属草本植物,全株均含有托品烷生物碱。虽然天仙子全株均含有莨菪碱和东莨菪碱,但其合成部位是侧根。天仙子是生产TAs的药材之一,但在其植株中生物碱含量低。虽然TAs能够被化学合成,但成本很高而不具有商业应用价值。有限的TAs来源导致其价格高昂,供不应求。因此采用生物技术方法培育TAs高产的天仙子等药用植物对于TAs生产具有重要意义。采用生物技术方法培育有效成分高产的药用植物通常有两种方法,一种是利用生物合成途径基因强化目标产物的生物合成能力,另一种是利用转录因子等调节基因调控特定生物合成途径而实现相关产物含量的提高。TAs生物合成途径研究十分深入,在颠茄（Atropa belladonna）中完整的途径已经被解析,但在天仙子中相关同源基因还没有被全部鉴定。TAs生物合成途径基因已经被用于培育TAs高产的药用植物。转录因子在培育有效成分高产的药用植物中同样可以发挥重要作用,甚至比生物合成途径基因具有更好的效果。但是,还未见天仙子中相关转录因子调控TAs生物合成的报道。本文从产TAs的茄科药用植物天仙子中克隆了一个AP2/ERF转录因子（HnERF1）,对其进行了相关生物信息学分析,采用转基因技术在天仙子毛状根中抑制/过表达HnERF1,研究其调控TAs生物合成的功能,取得了以下研究结果:***1候选基因克隆与表达分析通过分析对照和MeJA处理的天仙子毛状根转录组,总共获得50个AP2/ERF转录因子基因,对这50个AP2/ERF转录因子进行MeJA诱导表达相关性分析,发现转录组编号为comp70854＿c0＿seq1的AP2/ERF转录因子受到MeJA诱导表达最为强烈,遂将comp70854＿c0＿seq1（命名为HnERF1）作为候选转录因子开展后续研究。根据HnERF1的电子序列设计引物,以天仙子植株的cDNA为模板,克隆得到HnERF1的cDNA序列。HnERF1的cDNA序列长度为910 bp,编码区为630bp,编码209个氨基酸,含有一个由61个氨基酸构成的AP2结构域。预测分子量为23.2 k Da,等电点为9.06。HnERF1与茄科植物烟草、番茄和辣椒的AP2/ERF转录因子同源性高;HnERF1的AP2结构域的氨基酸序列与这些ERF亚家族转录因子的AP2结构域氨基酸序列高度相似。系统进化树分析表明,HnERF1与辣椒ERF转录因子在进化上亲缘关系最近。将HnERF1与其他植物中调控植物次生代谢产物合成的AP2/ERF转录因子的AP2结构域进行保守基序分析,发现HnERF1与这些AP2/ERF转录因子都有着两段高度保守的基序,有1个保守的WLG基序。采用qRT-PCR检测了HnERF1和6个天仙子已知TAs生物合成途径基因（HnODC、HnPMT、HnTRI、HnAr AT3、HnCYP80F1和HnH6H）的表达,结果显示HnERF1在天仙子根中高表达,这与TAs在天仙子根中合成的事实吻合。2.抑制HnERF1降低天仙子毛状根中托品烷生物碱的合成以天仙子无菌苗为植物材料,通过工程发根农杆菌C58C1（pRiA4、pBin19-HnERF1-RNAi）介导的外植体遗传转化,获得HnERF1干扰的天仙子毛状根。PCR检测结果表明,获得了6个转pBin19-HnERF1-RNAi的天仙子毛状根,在这些毛状根中能够同时检测到203 bp的35S::HnERF1 RNAi的片段、506 bp的卡那霉素抗性基因（NPTII）片段和423 bp的rolB基因片段;在空载体毛状根中仅能检测到NPTII和rolB基因片段。qRT-PCR分析结果显示,在6个转pBin19-HnERF1-RNAi的天仙子毛状根株系中,RI15、RI20和RI28这3个株系中HnERF1的表达量极显著下降,表明这3个株系中HnERF1被有效干扰。基于qRT-PCR的基因表达水平分析结果显示,在RI15、RI20和RI28这3个株系中HnODC、HnPMT、HnTRI、HnCYP80F1和HnH6H的表达量都显著下调,HnAr AT3的表达量没有显著性变化。进一步分析了抑制HnERF1对天仙子毛状根中代谢物含量的影响。与对照毛状根相比,HnERF1干扰毛状根株系中腐胺的含量平均降低了40.18%,N-甲基腐胺的含量平均降低了51.34%。莨菪碱的含量平均降低了21.50%,山莨菪碱的含量平均降低了57.18%,东莨菪碱的含量平均降低了32.52%。上述