鸭肠炎病毒US1蛋白分子特征与功能探究

作     者：李阳光 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：程安春;吴英;汪铭书

授予年度：2020年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸭肠炎病毒 ICP22 IE基因 转录调控 核定位信号 

摘      要：鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus,DEV）归属疱疹病毒科（Herpesvirales）,目前尚无DEV US1基因及其编码蛋白（ICP22）的相关报道。本文对鸭肠炎病毒US1蛋白的分子特征和功能展开研究,获得了以下结果:1.US1基因及编码蛋白的分子特征构建pet32a（+）-ICP22原核表达质粒,纯化ICP22重组蛋白后制备鼠抗ICP22抗体,随后检验抗体特异性并验证蛋白分子量。结果表明ICP22蛋白的分子量在原核和真核表达系统中均产生了约22 kDa分子量迁移,获得约57 kDa的蛋白,表明ICP22蛋白是一个翻译后修饰蛋白。随后用荧光定量和免疫印迹分别检测US1基因转录以及ICP22蛋白表达水平变化情况,结果显示两者变化趋势基本一致,分别在感染后0.5 h和2 h即可被检测到,表达量随时间增加而逐步上升,24 h或36 h达到峰值,随后随时间的延长而下降。此外,基因类型鉴定试验结果显示,US1基因转录不依赖于DNA和其他病毒蛋白的合成,为立即早期基因。2.US1基因单、双拷贝缺失株的构建及鉴定基于本实验室构建的鸭肠炎病毒细菌人工染色体平台,本文利用两步同源重组技术依次敲除DEV US1基因的2个拷贝,经PCR扩增、RFLP酶切鉴定确保单、双拷贝的US1基因已成功敲除,分别命名为GS1783-p BAC-DEV-ΔUS1、2ΔUS1。抽提US1基因缺失菌株质粒,转染至DEF细胞,进行重组病毒拯救。待出现荧光斑后收集病毒进行PCR、间接免疫荧光和免疫印迹等方法鉴定,确认无误后将收获的重组病毒分别命名为DEV CHv-BAC-G-ΔUS1和DEV CHv-BAC-G-2ΔUS1。3.US1基因对病毒增殖和基因转录的影响通过病毒滴度以及拷贝数测定,确定US1基因缺失可显著降低病毒基因组复制和病毒滴度。进一步的电镜结果显示,US1基因缺失可降低病毒粒子核出芽效率,细胞核内衣壳比例增加,核周完成初级囊膜化的病毒粒子占比减少,但是在细胞质中又均能观察到完成包被的成熟病毒粒子病毒,表明US1基因在病毒粒子成熟过程中具有重要作用,但并非必不可少。US1缺失株和亲本株的动态转录组分析结果显示,US1基因缺失后病毒基因的转录普遍被抑制,而细胞基因的转录水平则大多被上调。进一步的分析结果显示ICP22可以参与信号转导、细胞周期调控、RNA聚合酶转录等多个生物进程,涉及toll样受体、MAPK、Wnt、RNA POL Ⅱ、胞浆DNA传感等多条信号通路。RT-qPCR结果显示,US1基因缺失后引起MAT1A、MED23、TAF7L、EAF1、GTF2H2等RNA POLⅡ相关的基础转录因子表达水平上调,DNA修复分子BRCA1、转录负调控因子HEXIM1以及分子伴侣蛋白Hsp40C5B、周期蛋白Cyclin E等基因mRNA水平则明显下降。RT-qPCR验证结果和转录组数据变化趋势一致,也进一步说明转录组数据的可靠性。总之,DEV US1基因对细胞基因转录具有重要调控作用,其对病毒和宿主基因转录的调控可能通过基础转录因子等转录共通环节来实现。4.ICP22蛋白的细胞内定位及核定位信号鉴定生物信息学分析结果显示ICP22蛋白具有较强的主动入核能力。细胞内定位和NLS生物学功能鉴定结果显示在病毒感染和质粒转染情况下,ICP22蛋白均可主动入核并完全定位于细胞核,其中305-314位氨基酸是一个经典单分核定位信号,缺失此部分的ICP22无法主动入核。进一步的点突变试验结果表明,309R单突变和308-312KRKRP全部突变后ICP22蛋白均无法主动入核。对此我们构建了309R和308-312KRKRP突变病毒株,观察突变病毒株感染情况下的ICP22蛋白细胞内定位,结果显示,两种突变均可影响ICP22蛋白入核效率但不改变最终定位于核的特性。