粪产碱杆菌的分离鉴定、生物转化及基因测序分析

作     者：李敏 

作者单位：吉林农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：高云航

授予年度：2021年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：粪产碱杆菌 硫氧化基因 全基因组 转录组 qPCR验证 

摘      要：硫化氢(HS)作为畜牧生产过程中释放的一种有毒有害气体,可对动物机体造成伤害并对环境产生污染,因此去除HS特别是生物法氧化HS已逐渐成为当前研究热点。为筛选高效硫氧化菌株,研究其生物降解作用,了解菌株的特性和预测相关功能,本研究采集污水处理厂中活性污泥和禽类养殖场中粪便,分离鉴定异养硫氧化菌株,对其生长条件进行优化并测定转化性能,将菌株进行全基因组测序和转录组测序,分析氧化硫化物的关键基因。分离鉴定与转化性能研究实验结果表明,从畜禽养殖场的粪便和污水处理厂的活性污泥中筛选得到13株可耐受硫化物的细菌,命名为JLAF1～JLAF9,N1～N4。其中JLAF9菌株对硫化物的去除效果优于其他菌株,且菌株JLAF9的SO转化能力较强,最终将菌株JLAF9作为下一步研究对象。经鉴定,菌株JLAF9属于粪产碱杆菌,在生长条件优化为底物浓度0.5 g/L,温度35°C,初始p H7.0时,对硫化物转化率可达94%以上。对粪产碱杆菌JLAF9进行全基因组测序结果表明,粪产碱杆菌JLAF9由1条染色体组成,无质粒,全基因组总长度4,039,445 bp,平均测序读长为12,396bp,GC含量约为56.63%,编码基因3794个,编码基因的总长度为3,587,088 bp,占全基因组的88.8%。将预测到的基因在基因本体数据库(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)、同源蛋白簇数据库(Cluster of Orthologous Groups of proteins,COG)、碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate-Active en ZYmes Database,CAZy)中进行注释,其中GO数据库注释到2784个基因,KEGG数据库注释到2718个基因,COG数据库注释到3075个基因,CAZy数据库注释到86个基因,从注释结果中筛选得到研究报道过的3种硫氧化酶基因,分别为硫化物醌氧化还原酶sqr基因,Sox硫氧化系统中的sox Y和sox Z基因。对粪产碱杆菌JLAF9在有无硫诱导生长的环境中基因表达变化进行转录组测序,结果表明含硫与无硫环境中菌株差异表达基因共250个,其中上调基因有27个,下调基因有223个。富集分析结果表明,差异表达基因集中在辅助因子的生物合成通路(Biosynthesis of cofactors)、ABC转运通路(ABC transporters)、硫代谢(Sulfur metabolism)、甲苯降解(Toluene degradation)、硫胺代谢(Thiamine metabolism)、苯甲酸降解(Benzoate degradation)、芳香族化合物的降解(Degradation of aromatic compounds)等相关通路。粪产碱杆菌JLAF9基因组注释到的3种硫氧化酶基因和log2Fold Change2的基因q PCR验证结果表明,在硫源诱导前后,单血红素亚基fix O基因、亚硝酸盐还原酶nir K基因、硫化物氧化酶sox Y基因、硫化物氧化酶sox Z基因表达量显著升高,验证结果符合RNA-seq结果。而硫化物醌氧化还原酶sqr基因、整合酶家族蛋白if基因表达量无显著差异。