咪鲜胺对意大利青霉菌的抑制作用及其抗性机制的研究

作     者：张保 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱福兴

授予年度：2021年

学科分类：090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：意大利青霉菌 咪鲜胺 敏感性基线 抗性分子机制 相对表达量 

摘      要：意大利青霉菌(Penicillium italicum Wehmer)引起的柑橘青霉病是导致柑橘采后腐烂的一种重要病害。目前对柑橘青霉病的防治仍然以化学杀菌剂为主,甾醇14α-脱甲基化酶抑制剂(DMI)类杀菌剂咪鲜胺是我国防治柑橘青霉病最常用的杀菌剂,但是随着DMI类杀菌剂的广泛使用,意大利青霉菌对该类杀菌剂的抗药性问题日益严峻,因此开展对意大利青霉菌抗药性机制的研究变得尤为重要。本论文研究了咪鲜胺对意大利青霉菌生长、物质合成、抗氧化酶活性的影响和意大利青霉菌对咪鲜胺的抗性分子机制,主要研究结果如下:1.从全国5个地区的发病样品中分离纯化出164株意大利青霉菌菌株。测定咪鲜胺对意大利青霉菌菌丝在PDA培养基上生长抑制的有效中浓度(EC),建立了咪鲜胺对意大利青霉菌的相对敏感性基线,根据EC值的频率分布,把EC0.1μg/mL的16株意大利青霉菌被认为是敏感性下降的菌株,其EC值范围是0.2931-11.82μg/mL,抗性频率为9.76%。2.意大利青霉菌对咪鲜胺的敏感性和对丙环唑、氟硅唑的敏感性均成正相关(R=0.965,P0.001;R=0.912,P0.001),而与啶酰菌胺之间无显著相关性(R=0.179,P=0.415)。100和200μg/mL的咪鲜胺浸果处理对柑橘青霉病的保护作用防效分别为48.3%和78.6%。PDA中0.003、0.006和0.012μg/mL的咪鲜胺显著降低了意大利青霉菌的产孢量(P0.05),同时PDA上产生的孢子的致病力与对照相比也显著下降(P0.05)。3.PDA中的咪鲜胺可以显著降低意大利青霉菌孢子的萌发率和芽管伸长。低浓度下的咪鲜胺对孢子萌发率没有明显影响,只是延长了孢子萌发所需要的时间。咪鲜胺提高了菌丝体细胞膜的通透性。咪鲜胺处理后的菌丝中丙二醛、超氧根阴离子O的含量与对照相比均有显著上升,而过氧化氢的含量较对照相比则没有较为明显的变化。咪鲜胺处理的菌丝中超氧化物歧化酶活性持续上升,过氧化物酶活性与对照组相比差异不显著。4.与S型菌株相比,HR型菌株PiCYP51A氨基酸有7处突变(V14I,V35I,D93E,F170L,A181T,Y332H,F501L),LR型菌株PiCYP51A氨基酸有4处突变(V14I,V35I,D93E,Y332H),LR型和HR型菌株PiCYP51B氨基酸有4处突变(V49A,S77N,V192A,V476I)。氨基酸同源性分析表明,F501L突变和指状青霉菌CYP51B中F506I突变属于同源突变,推测意大利青霉菌对咪鲜胺的高抗性可能和F170L、A181T和F501L氨基酸的突变有关。LR型和HR型菌株PiCYP51A基因上游启动子区只有a127g突变,而PiCYP51B基因上游启动子区存在较多的碱基突变和片段缺失,其中两个较大的缺失片段分别为183 bp和81 bp。5.结合PiCYP51A/B、PiABC1/2基因的表达量和菌株的抗性水平分析,推测意大利青霉菌的低水平抗性可能与PiCYP51A基因的表达升高有关,而高水平的抗性可能与PiCYP51B基因的表达升高有关。PiABC1/2基因的表达升高可能与意大利青霉菌对咪鲜胺的抗性无关,尽管咪鲜胺处理诱导了PiABC1/2基因的表达升高。