基质金属蛋白酶-14电化学发光生物传感器的研究

作     者：孙利娜 

作者单位：西北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马芬

授予年度：2021年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 07[理学] 08[工学] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

主      题：电化学发光 生物传感器 夹心法 多肽抑制剂 

摘      要：癌症是全球范围内第二大致死病因,仅2020年死于癌症的患者达1000万,而癌症在早期是有可能治愈的。因此,早期诊断肿瘤细胞对于临床治疗至关重要,生物标志物是疾病诊断和判断疾病分期的一项重要生化指标。基质金属蛋白酶-14(Matrix Metalloproteinase-14,MMP-14)是多种恶性肿瘤的生物标志物,它是基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)中唯一一个可以在中性环境条件下降解胶原的膜型基质金属蛋白,参与了细胞的迁移,侵袭,增殖和凋亡等过程。所有MMPs的血红素(Hemopexin,PEX)结构域都呈高度保守的圆盘状结构,不同MMP的PEX结构域的第四条外链完全不同,这说明每一条外链介导了MMP与其他特定蛋白的作用。有研究显示,MMP-14的叶片I的第四外链参与了MMP-14与另一种肿瘤标志物CD44的异源二聚,叶片IV的第四外链参与了MMP-14之间的同源二聚。基于PEX-14筛选出来的多肽抑制剂能够有效抑制MMP-14与CD44的异源二聚及MMP-14的同源二聚。另外,MMP-14的催化结构域筛选出来的多肽能够被其特异性识别并切割。据文献报道,基于上述多肽与MMPs相互作用构建的MMPs生物传感器或传感方法大多数为信号抑制型,随着目标物MMPs的增加,检测信号不断降低。信号抑制型生物传感器因背景信号高、线性范围窄而限制其广泛应用。夹心法电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)生物传感器同时具备了ECL生物传感器选择性高、特异性强和灵敏度高的优势以及夹心法传感器线性范围宽的特点,被广泛用于各种生物标志物的检测中。本论文主要分别以MMP-14特异性切割多肽抑制剂以及MMP-14的PEX-14与多肽抑制剂的同源和异源聚合作用为识别体系,旨在设计高灵敏度、高选择性的检测肿瘤标志物MMP-14和CD44的ECL生物传感器。本论文共分为四章,每个章节的研究内容分别为:第一章为引言。简单概括了电化学发光生物传感器的概念及其分类,MMPs的研究进展及夹心型传感器的概述,最后为本论文的研究目的和研究内容。第二章为基于目标物切割多肽的MMP-14电化学生物传感器的研究。本章旨在研制一种简单、灵敏、高选择性的信号抑制型电化学生物传感器用于MMP-14和肿瘤细胞的检测。该生物传感器的设计以MMP-14特异性切割的多肽(Cys-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Ser-Trp-Gly-Leu-Lys,CK11)为分子识别物质,以二茂铁衍生物(Fc)为电化学信号物质,Fc标记的多肽CK11(CK11-Fc)为生物传感器的探针。首先CK11-Fc末端的Cys上的巯基通过Au-S自组装到金电极表面,然后用巯基己醇封闭电极表面的空缺位点,制备成检测MMP-14的电化学生物传感器。未结合MMP-14时,传感器界面的Fc覆盖量高,产生较强的电化学信号;结合MMP-14后,MMP-14在CK11-Fc中Gly和Leu之间特异性切割,使得部分Fc从传感器界面脱落,电化学信号降低。在优化条件下,电化学信号与MMP-14浓度在0.2 ng L-0.9 ng L范围内呈线性关系,检测下限为0.1 ng L。同时,电化学信号与高表达MMP-14的肿瘤细胞MCF-7在2×10 cells m L-2×10 cells m L范围呈线性关系。该工作首次构建了检测MMP-14以及高表达MMP-14的肿瘤细胞MCF-7的多肽电化学生物传感器,为临床检测与MMP-14相关肿瘤细胞以及筛选MMP-14抑制剂提供了研究平台。第三章为C功能化的夹心法电化学发光生物传感器用于检测MMP-14的研究。本章旨在研制一种信号增强型夹心法ECL生物传感器用于MMP-14和肿瘤细胞的检测。该生物传感器的设计以多肽Ap1为捕获探针,该探针与MMP-14特异性结合有效抑制了MMP-14的同源二聚;以用钌联吡啶衍生物(Ru)标记短肽Ap2(Ap2-Ru)为传感器的信号探针,Ap2与MMP-14特异性结合有效抑制MMP-14与CD44的异源二聚。首先将壳聚糖和C混合物修饰在玻碳电极上,通过戊二醛(GA)将氨基修饰的Ap1修饰在C修饰电极表面,并用牛血清蛋白(BSA)封闭,制备成ECL生物传感器。未结合MMP-14时,信号探针未与MMP-14特异性结合,传感器界面没有信号物质,因此没有ECL信号产生;结合MMP-14后,MMP-14进一步与信号探针Ap2-Ru特异性结合,电极表面引入信号物质,因此检测到ECL信号,并且随着MMP-14浓度的增加,ECL信号随之增强,该传感器为信号增强型。在优化条件下,ECL信号与MMP-14浓度在0.05ng L-7.0 ng L范围内呈线性关系,检出限为8.1 pg L。同时,ECL信号与高表达MMP-14的肿瘤细胞MDA-MB-231在3×10 cells m L-3×10 cells m L范围内呈线性关系。该工作首次构建了基于多肽抑制剂与MMP-14特异性结合的夹心法ECL传感器,与报道的信号抑制型传感器相比,该传感器以背景信号低、线性范围宽、灵敏度高等优点有望用于研究抑制剂与MMPs相互作用,筛选药物等领域。第四章为基于钴钼碳纳米纤维功能化的MMP-14电化学发光生物传感器用于检测CD44。本章旨在研制一种简单、快速、灵敏的ECL生物传感器用于CD44和肿瘤细胞的检测。该传感器的设计以Co,MoC-CNF@PDA作为电极修饰材料,以MMP-14为分子识别物质,以Ru为ECL信号物质。首先将Co,MoC-CNF@PDA修饰在电极表面,然后通过酰胺化反应将Ru标记的MMP-14(Ru-MMP-14)共价键合在修饰电极表面制备成MMP-14ECL生物传感器。未结合CD44时,传感器界面检测到较强的ECL;结合CD44后,由于CD44分子阻碍了电极表面的电子转移,ECL信号降低,并且随着CD44浓度的增加,ECL信号随之降低。在优化条件下,ECL信号与CD44浓度在0.002 ng m L-250 ng m L呈线性关系,检出限为0.001 ng m L。同时,ECL信号与高表达MMP-14的肿瘤细胞MDA-MB-231在5×10 cells m L-5×10 cells m L范围内呈线性关系。该工作首次构建了检测CD44以及高表达CD44的肿瘤细胞MDA-MB-231的ECL生物传感器,为临床检测与CD44相关肿瘤细胞以及筛选CD44抑制剂提供了研究平台。