CTSB、CTSD对黔北麻羊卵泡颗粒细胞生物学行为及产羔性状的影响研究
作者单位：贵州大学
学位级别：硕士
导师姓名：陈祥
授予年度：2021年
主 题：黔北麻羊 产羔性状 CTSB基因 CTSD基因 表达调控
摘 要：组织蛋白酶B（Cathepsin B;CTSB）与组织蛋白酶D（Cathepsin D;CTSD）均是位于溶酶体内的组织蛋白酶家族成员,在哺乳动物的细胞、组织中广泛表达并参与机体各项生理活动。黔北麻羊为贵州省优良地方山羊品种,具有繁殖性能好,适应性强等特点。课题组前期以单、多羔黔北麻羊卵巢为模板,通过转录组测序筛选出CTSB与CTSD基因在单、多羔黔北麻羊卵巢中存在差异表达。因此,本试验以黔北麻羊为对象,以CTSB、CTSD为靶标基因,在m RNA、细胞、蛋白等多个水平开展研究,旨在探明CTSB与CTSD基因与蛋白的有效性,深入解析CTSB与CTSD对黔北麻羊产羔性状的调控机制。主要研究结果如下:1.选取体重相近、饲养方式、免疫水平等外部因素均相同且处于卵泡期的单、多羔黔北麻羊母羊（与前期转录组测序所处时期一致）各5只进行屠宰。使用RT-q PCR、Western blotting、IHC等方法检测CTSB与CTSD在单、多羔黔北麻羊性腺组织中的表达差异及在卵巢中的定位情况。结果发现,CTSB与CTSD在黔北麻羊性腺组织中均有表达,且高表达于卵巢。Western blotting检测发现CTSB与CTSD蛋白在单羔卵巢中的表达量极显著高于多羔卵巢（P0.01）。IHC结果表明CTSB与CTSD蛋白均在山羊的各级卵泡及颗粒细胞中存在表达,且在颗粒细胞中高表达。以上结果表明CTSB与CTSD基因能在黔北麻羊性腺组织中差异表达,其蛋白主要定位于颗粒细胞且在单、多羔卵巢中具有差异表达。提示CTSB与CTSD对黔北麻羊的繁殖性状,特别是产羔数具有重要作用。2.为了在细胞中探究CTSB与CTSD对多胎性状的调控机制,试验前期克隆了CTSB与CTSD基因CDS区进行生物信息学分析,构建p EGFP-N3-CTSB/CTSD真核表达载体和sh-CTSB/CTSD沉默表达载体。菌液PCR及测序结果显示黔北麻羊p MD-19T-CTSB/CTSD亚克隆载体构建成功,生物信息学分析发现黔北麻羊CTSB基因编码序列与山羊CTSB基因编码序列存在1处突变,而黔北麻羊CTSD基因编码序列则与山羊完全吻合。此外,黔北麻羊CTSB蛋白是理论等电点为5.65,分子量为36.78 k Da,主要由无规则卷曲构成的相对不稳定亲水性蛋白,有信号肽、40个磷酸化位点、1个N-糖基化位点与Pept＿C1的特殊结构域。系统进化树分析显示黔北麻羊CTSB蛋白高度符合物种进化规律。黔北麻羊CTSD蛋白是理论等电点为7.03,分子量为44.59 k Da,主要由无规则卷曲构成的相对稳定疏水性蛋白,具有信号肽,存在跨膜区域（结构域）、42个磷酸化位点与3个N-糖基化位点。系统进化树结果与黔北麻羊CTSB蛋白一致,且CTSB与CTSD蛋白之间存在较强的互作关系。此外,双酶切及测序结果均表明黔北麻羊p EGFP-N3-CTSB/CTSD真核表达载体与沉默表达载体sh-CTSB/CTSD构建成功,为进一步在细胞中探究CTSB与CTSD基因功能奠定基础。3.为深入解析CTSB与CTSD对黔北麻羊产羔性状的调控机制。试验以卵泡颗粒细胞为模型,将各重组质粒导入细胞验证其对细胞增殖、凋亡、周期及相应标志基因表达的影响。同时以山羊多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR、INHA为参照,探究CTSB与CTSD对其在转录与翻译水平的表达变化。结果发现CTSB与CTSD过表达后能显著抑制细胞增殖并降低PCNA的表达（P0.05）;促进细胞凋亡并显著降低细胞凋亡相关基因Bcl-2（P0.05）、极显著增加Bax与Caspase-3基因的表达（P0.01）;同时,CTSB与CTSD的过表达能改变细胞周期进程并极显著增加细胞周期蛋白Cyclin A1、降低Cyclin D2与Cyclin E的表达（P0.01）;此外,过表达CTSB与CTSD还能降低颗粒细胞中多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR与INHA在转录与翻译水平的表达（P0.05）。而在颗粒细胞中敲低CTSB与CTSD表达后能促进细胞增殖、抑制细胞凋亡并改变细胞周期进程,增加PCNA（P0.01）、Bcl-2（P0.05）、Cyclin D2（P0.01）与Cyclin E（P0.01）与BMPR-IB（P0.01）、FSHR（P0.01）与INHA（P0.01）的表达量,降低Bax、Caspase-3（P0.05）、Cyclin A1（P0.01）等相关基因的表达。综上,CTSB与CTSD可能通过调节PCNA、Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cyclin A1、Cyclin D2、Cyclin E基因的表达来调控颗粒细胞的增殖、凋亡、周期,进而影响颗粒细胞的生物学功能,并通过改变颗粒细胞中多胎性状候选基因BMPR-IB、FSHR与INHA的表达间接影响卵泡发育及排卵,从而间接调节山羊的产羔。
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