二氢丹参酮Ⅰ对钙盐诱导的主动脉瓣膜间质细胞成骨样表型转变的作用及机制探究

作     者：吴静红 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：施琼

授予年度：2021年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：钙化性主动脉瓣膜病 瓣膜间质细胞 二氢丹参酮Ⅰ 成骨样表型转变 

摘      要：目的:探讨二氢丹参酮Ⅰ（dihydrotanshinone I,DHI）对成骨培养基（Osteogenic Medium,OM）诱导的原代猪瓣膜间质细胞（porcine valve interstitial cells,PVICs）成骨样表型转变的作用和机制,为临床干预钙化性主动脉瓣膜病（calcific aortic valve disease,CAVD）提供理论基础和科学依据。方法:通过免疫组织化学染色（IHC）对3例钙化性主动脉瓣和2例非钙化性主动脉瓣进行检测,观察成骨指标Runx2、OPN和炎症指标IL-1β、p-NF-κB（p-P65）的表达情况。体外分离健康家猪主动脉瓣膜间质细胞（PVICs）并通过免疫荧光进行表型鉴定。通过OM诱导PVICs成骨样表型转变,CCK8法确定二氢丹参酮Ⅰ（DHI）最佳干预浓度及时间。早期钙化情况通过碱性磷酸酶染色（ALP染色）检测,晚期成骨改变通过茜素红S染色指示;q PCR和Western blot检测成骨指标Runx2和OPN核酸和蛋白水平的改变;Western blot检测NF-κB、ERK1/2和Smad1/5/8通路的改变情况。结果:在钙化性主动脉瓣膜标本中,成骨指标（Runx2、OPN）和炎症相关指标（IL-1β、p-NF-κB）表达较正常对照组均明显上调。细胞免疫荧光显示v WF阴性、vimentin阳性和α-SMA阳性,提示成功PVICs。实验分为Blank组,OM组,OM+DMSO组,OM+DHI组。在OM诱导PVICs成骨样表型转变的基础上,OM组和OM+DMSO组相较于Blank组而言,成骨指标Runx2和OPN的表达上调,ALP染色和茜素红S染色显示钙沉积增加;DHI（10μM）处理后,与OM组和OM+DMSO组相比,钙化指标Runx2和OPN的表达水平下调,ALP染色和茜素红S染色钙盐显示沉积减少,且NF-κB、ERK1/2和Smad1/5/8的磷酸化水平受到抑制。结论:DHI（10μM）处理后可逆转钙盐诱导的PVICs成骨样表型转变,其机制可能与NF-κB、ERK1/2和Smad1/5/8通路有关。