基于力化学偶联手段的核酸适配体性能表征与优化研究

作     者：马启慧 

作者单位：合肥工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：瞿昊;陈迪虎

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 080202[工学-机械电子工程] 08[工学] 0802[工学-机械工程] 100701[医学-药物化学] 10[医学] 

主      题：适配体 力化学偶联 分子力钳 折叠能量 亲和力 

摘      要：自2004年第一个基于核酸适配体的药物Macugen被成功运用于临床治疗后,核酸适配体药物便有了一定的发展。然而,目前用于临床治疗的适配体药物只有少数几种,而造成这种现象的原因之一是适配体的构象稳定性差。适配体折叠能量是评估适配体构象稳定性的重要参数,但是目前测量适配体折叠能量的方法有限且存在一定的误差。除上述基于适配体的药物发展所面临的问题之外,基于适配体的生物传感器同样面临着一定的困难。由于通过SELEX技术筛选获得的适配体具有特定的折叠构象且无法自发进行构象调控,所以使得基于适配体的生物传感器的检测范围有限。而目前调控适配体构象的方法存在缺陷,无法精确和可控的对其进行调控。造成上述两个问题的根本原因是缺乏有效的手段对适配体结构稳定性进行表征和优化。针对这一问题,本课题基于力化学偶联手段,从如何在平衡态下测量适配体折叠能量以及如何精确和可预测的调控适配体构象和亲和力这两个具体问题入手展开了研究,研究内容如下:1、用双链分子力钳测量适配体的折叠能量。本文提出了一种在平衡态下简单的测量适配体折叠能量的方法。首先,在平衡条件下用耦合在适配体两端的双链DNA“分子力钳拉伸适配体。然后,用延时凝胶电泳测量约束DNA分子的总内能,并比较含有相同分子力钳的非结构化的随机单链DNA的内应力分子的折叠和展开行为,以推导出分子力钳的折叠能。利用上述方法测量出HD22凝血酶适配体的折叠能量为10.40 kJ/mol,与其他预测和估计值一致。此外,本文还测量了一个简单的发夹结构的折叠能量(9.05 kJ/mol),与DINAMelt软件预测值(9.24kJ/mol)一致。2、用双链分子力钳调控适配体亲和力。本文以相干长度小于50 nm的双链DNA分子力钳作为机械力来源调控HD22凝血酶适配体的亲和力。实验结果表明,通过调节双链DNA分子力钳的长度可以半连续的调节适配体与靶标的结合亲和力,使HD22凝血酶适配体的亲和力朝着减小的方向移动。另外,通过增加分子力钳两端单链长度和增加双链处缺口长度来释放弯曲DNA的机械应力,可以半连续调控适配体亲和力,使其亲和力朝着增加的方向移动。综上所述,分子力钳可以精确、可逆和可预测地调控适配体和靶标的结合亲和力,从而调控基于适配体的生物传感器的检测范围。该方法对基于适配体的生物传感器在生物医药和检测等领域的发展具有重要意义。