左、右归丸对AMPK/mTOR通路介导的PMOP大鼠骨形成的实验研究

作     者：陈知斌 

作者单位：辽宁中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：任艳玲

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：PMOP 骨形成 左归丸 右归丸 AMPK/mTOR信号通路 阴阳互济 

摘      要：目的:本实验基于中医“肾藏精,主骨生髓以及“阴阳互济理论,研究左、右归丸调控AMPK/m TOR信号通路对PMOP大鼠骨形成的影响,进一步探讨左、右归丸在防治PMOP过程中对骨形成的作用机制。材料与方法:SPF级2月龄SD雌性未生育大鼠60只,随机分为空白组(KB组)8只,假手术组(SHAM组)8只,造模组44只。从背部入路摘除双侧卵巢建立PMOP大鼠模型,SHAM组切除卵巢周围与卵巢等大体积的脂肪组织。术后,将造模组随机分为模型组(OVX组)、补佳乐组(BJL组)、左归丸组(ZGW组)、右归丸组(YGW组),适应性喂养7d之后,灌胃给药,1次/d,给药12W。剔除造模、灌胃、营养不良等因素导致不符合纳入实验标准的大鼠12只,共纳入实验大鼠48只。末次给药后,禁食12h。采用腹主动脉取血、静置、离心、分装血清,-80℃保存;取大鼠左腿股骨,剔除肌肉、筋膜组织,剪断两端,用PBS缓冲液反复冲洗骨髓腔,至骨干发白,将含有骨髓的PBS缓冲液离心、分装,置于-80℃冰箱保存;取大鼠右腿股骨,剔除肌肉、筋膜组织,生理盐水纱布包裹,-80℃冻存;游离腰椎,取大鼠L3-L5腰椎,剔除肌肉组织,用4%的多聚甲醛固定。采用Micro-CT检测大鼠L3-L5腰椎的骨量参数以及三维结构重建,评价大鼠腰椎骨微结构;采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清BGP、BALP的含量;采用Real time PCR法检测大鼠股骨、骨髓中COL I、Runx2以及中骨髓AMPKα、m TOR的基因表达;采用western-blot法检测大鼠股骨、骨髓中Runx2、COL I、ALP、BGP蛋白表达以及骨髓中AMPKα、m TOR的蛋白磷酸化水平。结果:1左、右归丸对PMOP大鼠骨形成的影响1.1左、右归丸对PMOP大鼠腰椎骨微结构参数及形态学的影响Micro-CT检测结果显示,与KB组比较,OVX组BMD、BS/TV、BV/TV、Conn-Dens、***显著降低(P0.01),BS/BV、***显著升高(P0.01),骨小梁由板状结构向杆状结构变化,骨小梁结构稀疏、细小、断裂增多,排列不均,骨微结构明显破坏,提示成功制备PMOP大鼠模型。与OVX组比较,ZGW、YGW和BJL组BMD、BS/TV、BV/TV、Conn-Dens、***显著升高(P0.05),BS/BV、***显著降低(P0.05),骨小梁板状结构增多,骨小梁结构紧凑、增粗、断裂减少,排列均匀。1.2左、右归丸对PMOP大鼠血清BGP、BALP浓度的影响研究结果显示,与KB组比较,OVX组血清BGP、BALP含量明显升高(P0.01);与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组血清BGP、BALP含量明显降低(P0.01);与BJL组比较,ZGW组血清BGP、BALP含量无明显差异(P(29)0.05),YGW组血清BALP含量升高(P0.01),YGW组血清BGP含量无明显差异(P(29)0.05)。1.3左、右归丸对PMOP大鼠骨、骨髓组织COL I、Runx2基因与蛋白表达的影响1.3.1左、右归丸对PMOP大鼠骨、骨髓组织COL I、Runx2基因表达的影响研究结果显示,与KB组比较,OVX组骨、骨髓COL I、Runx2基因表达显著降低(P0.01);与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组骨、骨髓COL I、Runx2基因表达显著升高(P0.05),与BJL组比较,ZGW组骨COL I基因表达显著升高,YGW组显著降低(P0.05),两组骨髓COL I基因表达无显著性差异(P(29)0.05),ZGW、YGW组骨、骨髓Runx2基因表达无显著性差异(P(29)0.05)。1.3.2左、右归丸对PMOP大鼠骨、骨髓组织COL1、Runx2蛋白表达的影响研究结果显示,与KB组比较,OVX组骨、骨髓COL I、Runx2蛋白表达显著降低(P0.01);与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组骨、骨髓COL I、Runx2蛋白表达显著升高(P0.01);与BJL组比较,ZGW组骨、骨髓COL I蛋白表达显著升高(P0.01),YGW组骨COL I蛋白表达显著升高(P0.01),骨髓COL I蛋白表达无显著性差异(P(29)0.05),ZGW组骨髓Runx2蛋白表达显著降低(P0.01),骨Runx2蛋白表达无显著性差异(P(29)0.05),YGW组骨、骨髓Runx2蛋白表达显著降低(P0.05)。1.4左、右归丸对PMOP大鼠骨、骨髓组织BGP、ALP蛋白表达的影响研究结果显示,与KB组比较,OVX组骨、骨髓BGP蛋白表达显著降低(P0.01);与OVX组比较,ZGW、YGW、BJL组骨、骨髓BGP蛋白表达显著升高(P0.01);与BJL组比较