牛病毒性腹泻病毒离子通道蛋白p7的互作蛋白筛选及功能研究

作     者：郭妍婷 

作者单位：新疆农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：史慧君;付强

授予年度：2021年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：牛病毒性腹泻病毒 p7 离子通道蛋白 TurboID CRISPR/Cas9 

摘      要：牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)主要感染牛、羊、猪、骆驼等多种动物,造成腹泻、黏膜糜烂、免疫抑制、繁殖障碍等症状,还会污染血清、冻精、胚胎等牛源生物制品,给养殖业及其他相关产业造成严重的经济损失。BVDV p7是由疏水氨基酸构成的一个小分子肽,在脂质双分子层膜上形成通道蛋白且具有离子通道的活性,属于病毒孔蛋白(Viroporin)家族。大量研究表明病毒孔蛋白在许多病毒复制周期中起到关键作用。目前有关BVDV p7离子通道蛋白的研究较少,p7离子通道的形成过程中需要哪些蛋白参与?该蛋白如何参与BVDV复制过程?尚不清楚,亟待研究阐明。本研究利用邻近生物素化蛋白标记系统Turbo ID筛选与p7互作的蛋白,使用CRISPR/Cas9敲除互作蛋白,探究互作蛋白影响BVDV复制的作用,为进一步阐明p7形成离子通道的机理提供依据,也为BVDV防控新方法的建立提供靶点。具体内容如下:*** p7多肽多克隆抗体的制备和鉴定根据Gen Bank中BVDV毒株NADL p7氨基酸序列信息进行生物信息学分析,合成表面抗原多肽并偶联血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)作为载体蛋白,经反相高效液相色谱纯化、分析纯度,质谱进行定性鉴定;用弗氏佐剂乳化后,皮下注射免疫新西兰大白兔,多肽亲和柱纯化血清,获得多肽多克隆抗体,间接ELISA和SDS-PAGE进行抗体效价和纯度检测;BVDV NADL感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)后免疫荧光染色检测多肽多克隆抗体的反应性和特异性。生物信息学分析显示p7蛋白的主要抗原表位分布在氨基端,偶联KLH后合成多肽MSQYGAG EIVMMGN-Cys-KLH,纯化后多肽纯度可达80.19%;间接ELISA检测多肽多克隆抗体效价为1:100,000,Western blot检测抗体的纯度为90.2%;免疫荧光(Immunological fluorescence assay,IFA)染色检测发现该抗体在BVDV NADL感染的MDBK细胞的细胞膜上呈现阳性染色,与p7离子孔道定位相符。*** ID系统筛选BVDV p7蛋白的互作蛋白构建慢病毒载体p LVML-Myc-p7-(GGGS)3 linker-Turbo ID-IRES-Puro和p LVML-Myc-(GGGS)3linker-Turbo ID-IRES-Puro;包装慢病毒感染MDBK细胞,使用嘌呤霉素筛选3代后获得稳定表达p7-Turbo ID和Turbo ID的细胞,Western blot检测p7表达情况;用不同浓度的Biotin在不同时间段处理细胞,Western blot鉴定Turbo ID的生物素连接酶活性及确定Biotin处理的最适浓度和时间;将稳定表达p7-Turbo ID和Turbo ID的细胞扩大培养并用Biotin处理,裂解细胞提取蛋白用DynabeadsMy OneStreptavidin T1磁珠进行亲和层析后蛋白质谱分析。试验结果表明:Western blot鉴定p7在细胞中表达;50μΜBiotin处理细胞18 h效果最佳;对筛选的互作蛋白进行生物信息学分析,主要富集的生物学过程和通路为对内质网应激的反应和内质网介导的蛋白降解途径等,其中SEC22B、STX5、ANAP29、SRPRA和HSPA5等蛋白参与构成以上生物学过程和通路的蛋白-蛋白互作网络。*** p7互作蛋白的功能研究挑选13个可能参与p7形成离子通道的互作蛋白,设计sg RNA并克隆至lenti CRISPR v2载体,包装慢病毒感染MDBK细胞,嘌呤霉素筛选获得阳性细胞,BVDV感染不同时间后使用荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)、IFA、致细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)和测定病毒滴度等检测BVDV复制情况,研究敲除与p7相互作用的蛋白对BVDV复制的影响。qRT-PCR检测发现SPCS1、VAPA和SEC22B敲除显著性降低BVDV 5’UTR m RNA水平;BVDV感染12、24、36和48 h后,SPCS1、VAPA和SEC22B基因敲除后显著性阻止绿色荧光标记的BVDV双链RNA(Double strand RNA,ds RNA)积累,减弱BVDV感染造成的CPE,降低子代病毒滴度。本研究成功制备具有较好反应性和特异性的兔抗BVDV p7多肽多克隆抗体,为进一步研究p7形成离子孔道的机理提供了有利工具;通过Turbo ID邻近蛋白标记技术筛选获得与BVDV p7互作的蛋白,CRISPR/Cas9敲除SPCS1、VAPA或SEC2