创伤性颅脑损伤患者血清外泌体miRNA差异性表达谱分析
作者单位：山西医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：黄忻涛
授予年度：2021年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学]
主 题：创伤性颅脑损伤 外泌体 miRNA 差异性表达 功能富集分析
摘 要：目的:创伤性颅脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）在平常和战时均常见,是致死率、致残率最高的中枢神经系统疾病的问题。TBI后可引起外周血循环中外泌体（Exosome,Exo）miRNA（microRNA）的改变。通过对TBI患者血清Exo miRNA的测序分析,挖掘与TBI密切相关的差异性Exo miRNA及相关通路,并结合生物信息学分析技术,预测差异基因的作用靶点,寻找可用于诊断、治疗TBI的潜在的新型生物标志物。方法:1.该前瞻性研究选择就诊于山西医科大学第一临床医学院神经外科及急诊医学科的TBI患者14例,根据GCS评分将患者分为轻中度TBI（mild or moderate TBI,mTBI）（8分GCS15分）7例、重度TBI（severe TBI,sTBI）（GCS≤8分）7例,对照（control）组选择为同一时期的健康体检者6例,采集TBI患者24小时内术前外周血8～10ml,control组中体检者外周血样本8～10ml,静置2小时,离心提取血清,-80℃冷冻保存。2.采用Exo提取试剂盒提取TBI患者外周血血清中Exo,通过TM、NTA及WB鉴定Exo的形态大小、浓度及质量。3.采用Trizol试剂提取Exo中总RNA,并利用Illumina公司的TruSeqRNA方法建库并进行测序分析,筛选已知miRNA,预测新的miRNA。着重各样本已知miRNA的表达量分析。4.采用DESeq（version1.18.0,Anders S和Huber W,2010）对miRNA行差异性表达分析,筛选具有统计学意义的差异性表达Exo miRNA（|log2FC|1、P0.05）。5.使用miranda、mi RWalk、miRTarBase和Targetscan对差异表达Exo miRNA行靶基因预测。6.采用GO功能注释和KEGG通路分析对差异性表达的miRNA的靶基因行功能富集分析。其中,GO功能注释包括:BP、CC和MF,了解差异表达的Exo miRNA在TBI病理变化中发挥的作用。7.使用String数据库和Cytoscape3.6.1软件构建靶基因间PPI关系网络并进行可视化,进一步了解差异表达miRNA靶基因之间的关系。8.统计学方法:所有统计数据的分析均在SPSS 25.0中进行。数据表示为平均值±标准差。t检验用于评估两组之间的差异。采用单因素方差分析,选取双尾范围,计算出对照组、mTBI、sTBI两两之间差异性表达Exo miRNA。当P0.05时,认为差异具有统计学意义。结果:***组与TBI组血清样本中提取Exo及Exo miRNA合格,行高通量测序及数据分析。2.通过对各组样本的miRNA进行差异表达分析,与control组相比,mTBI组中有113个miRNA存在显著性差异（P0.05;|log2FC|1）,其中,63个miRNA表达上调,表达下调的miRNA有50个;s TBI组中有71个miRNA存在显著性差异,其中14个miRNA表达下调,57个miRNA表达上调;与mTBI组比（P0.05;|log2FC|1）,s TBI组中存在61个差异性表达miRNA,其中,45个miRNA表达上调,16个miRNA表达下调。mTBI与sTBI筛选出27个共同表达的具有显著差异的miRNA。control组及mTBI与sTBI筛选出3个共同表达的具有显著差异的miRNA。3.在TBI领域主要涉及细胞增殖、衰老、Rap1信号通路、MAPK信号通路、细胞粘附分子（CAMs）、钙信号通路等炎症相关信号通路以及γ-氨基丁酸突触、多巴胺能神经突触、含血清素的神经突触、神经营养因子信号通路等神经血管重塑相关的通路。***-206、miRNA-21-3p、miRNA-9-3p和miRNA-124-3p等是TBI后的Exo囊泡运输、细胞衰老、神经营养因子及炎症变化等信号通路中的关键基因。***5L、CDC42、MAPK、FRS2等作为靶基因在TBI病理生理变化中发挥重要功能作用。结论:*** miRNA随着TBI患者的损伤程度不同,存在显著差异性。***-206、miRNA-21-3p、miRNA-9-3p和miRNA-124-3p等是TBI中涉及炎症相关通路及神经血管因子信号通路中的关键基因。***5L、CDC42、MAPK、FRS2等是TBI病理生理发生发展过程中的主要靶基因。
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