犬细小病毒2c亚型的分离鉴定及马抗CPV-2c精制免疫球蛋白的制备

作     者：莫若 

作者单位：吉林农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王开

授予年度：2021年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：犬细小病毒 基因型 马抗血清 免疫球蛋白IgG 

摘      要：犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)属于细小病毒科、细小病毒属成员,主要感染犬科、鼬科、浣熊科等肉食动物,感染后引起腹泻、出血性肠炎、心肌炎等临床症状,是造成犬科等肉食动物死亡的主要病原。目前,CPV已呈世界性流行,严重威胁着家养及野生肉食动物的健康,也对毛皮动物养殖造成了严重的经济损失。疫苗接种是预防该病的主要手段,但是由于CPV变异频繁,使疫苗不能完全阻止CPV的感染。由于VP2基因氨基酸的变异,犬细小病毒已经由最初的CPV-2逐渐演变成CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c等多种亚型,并在不同地区形成不同的流行趋势。因此,了解CPV地方流行特征,对该病的防治具有重要意义。此外,无针对该病的特异性治疗药物,临床普遍采用对症治疗。因而,安全快速的特异性治疗制剂是CPV治疗的首选。马源抗体的制备,相对其他抗体有着成本低、采血量大、抗体产量高的优势。因此,开展针对CPV的马抗免疫球蛋白的研究有着重要的意义。首先,本研究对长春市不同宠物医院就诊犬的粪便样品进行CPV检测,并进行了基因亚型分析与病毒分离鉴定。20份粪便样品中检测出15份CPV阳性,VP2基因氨基酸位点与遗传进化分析显示15份样品均为CPV-2c亚型。使用F81细胞成功分离到1株病毒,经间接免疫荧光、透射电镜与PCR鉴定为CPV,命名为CC/JS-01。该毒株稳定传代8代,血凝效价为1:2,病毒滴度为10TCID/m L。VP2基因扩增与遗传进化分析显示该毒株与CPV-2c亚型参考毒株同属一个分支,且与中国流行株亲缘关系最近。然后,通过将CPV-2c亚型的病毒样颗粒与弗氏佐剂混合乳化制备免疫原,并对马进行免疫,经中和试验观察马血清中和抗体效价变化,而后将制备的马抗CPV高免血清通过饱和硫酸铵沉淀提取免疫球蛋白IgG,对其纯度及CPV-2c亚型的中和抗体效价进行检测。结果显示,硫酸铵沉淀所提取的IgG经SDS-PAGE分析在55KDa左右具有完整的蛋白条带,应用薄层扫描测得其纯度为91.63%,制备的马抗CPV-2c精致免疫球蛋白中和效价为1:6451.6。此外,对所制备的IgG进行无菌检验为合格,证明制得的免疫球蛋白IgG安全性良好。综上,本研究证明CPV-2c亚型是近年来长春地区的优势流行毒株,并成功分离到1株CPV-2c,制备了针对CPV-2c具有高中和效价的马抗免疫球蛋白,为长春地区犬细小病毒的综合防控提供了理论依据,也为CPV的治疗抗体的研制提供了可参考的技术方法。