耐辐射奇球菌RecA介导的DNA双链断裂修复动力学研究

作     者：沈望焘 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何淑雅

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：耐辐射奇球菌 DNA双链断裂 动力学 RecA 

摘      要：目的:耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans,DR)是世界上辐射抗性最强的生物之一,电离辐射能诱发大量的DNA双链断裂(Double strands break,DSB)。RecA是D.radiodurans针对DSB进行同源重组修复过程中的关键酶。本研究旨在通过检测荧光标记的RecA的定位和定量信息,用数学描述反应和扩散过程建立适用于D.radiodurans的RecA募集动力学模型,并寻找D.radiodurans修复DSB高效性的原因,对于揭示其修复过程中的限速步骤有重大意义。方法:1.以D.radiodurans基因组和pUCm-T-syfp2质粒为模板PCR扩增带Nde I和Not I酶切位点的syfp2和带有Not I和Bam HI酶切位点的recA基因,再与pRADK质粒分别酶切后用T4连接酶三段连,构建pRADK-syfp2-recA载体。用Ca Cl法将pRADK-syfp2-recA转入D.radiodurans,用于观测RecA非定量行为。2.大量扩增pRADK-syfp2-recA载体,以D.radiodurans基因组PCR扩增末端带Asc I的ThpR基因,以pRADK为模板PCR扩增末端带Asc I、Nde I酶切位点的Kan抗性基因,三者分别酶切连接,构建thpR-kan R-syfp2-recA线性DNA分子,用Ca Cl法将其转入DR通过自发同源重组使kan R-syfp2-recA替换原先recA基因,得到稳定的转基因D.radiodurans,用于观测RecA定量行为。3.对上述实验对象冰上辐射后,去冰置于共聚焦皿或载玻片上,维持室温在30℃,辐照前后在LSM880激光共聚焦显微镜下拍摄荧光照片,计算实时荧光强度。4.使用持续外界压力反应链模型及其他方程进行动力学参数拟合,与公开数据集进行比较,获得DNA修复过程新的发现。结果:1.PCR反应获得长度约为1000bp的recA、750bp的syfp2片段,三段连获得pRADK-syfp2-recA重组载体,测序结果显示构建序列与模板序列一致,无碱基突变。将pRADK-syfp2-recA转入D.radiodurans,Amp筛选到阳性克隆子,得到目标融合蛋白稳定表达的转化DR。2.1600Gyγ射线冰上辐射前后在激光共聚焦显微镜下观察连续的RecA募集动力学过程,意外的观察到RecA在未辐照时多结合于细胞膜上,在受辐射刺激后,RecA向DNA区域迁移,随着修复进行,RecA缓慢从DNA上移除,重新结合到细胞膜上。3.通过非定量行为结果分析显示RecA消除动力学呈现一级指数衰减的特征,拟合优度R=0.998928。使用三阶CRC模型卷积辐射方波信号拟合获得具体特征参数。边照射边修复阶段RecA募集动力学结果与模型预测高度一致,R=0.9853。4.RecA募集动力学拟合参数与人类Rad51动力学公开数据比较,得到RecA(DR)的消除速率常数为Rad51(homo sapiens)的265倍,但募集速率不如Rad51(homo sapiens)。5.PCR反应获得长度约为700bp的thpR基因和800bp的Kan R片段,用T4连接酶三段连获得thpR-kan R-syfp2-recA线性DNA分子,直接用于转染,Kan筛选到阳性克隆,即转基因D.radiodurans。6.1600Gyγ射线冰上辐射后在激光共聚焦显微镜下观察连续的RecA表达动力学过程,观察到受辐射刺激后RecA表达提高1.7倍,并且在1h内达到峰值。7.通过定量行为结果分析显示RecA表达动力学呈现表达激活函数的特征,拟合优度R=0.999851。RecA表达动力学参数与公开的基因芯片表达参数比较,得到两种方法的参数具有很好的一致性。结论:1.本研究通过瞬时转染和稳定转染分别构建了两种表达SYFP2-RecA融合蛋白的D.radiodurans,可在激光共聚焦显微镜下检测RecA动力学,为动力学研究提供了一种可行方法。2.本研究在观测RecA的表达与迁移行为的实验数据基础上,采用三阶CRC模型卷积辐射方波信号的方式,初步建立了RecA募集行为动力学模型,可用于预测D.radiodurans应对瞬时辐射的修复过程和边辐射边修复阶段的动力学预测。3.通过募集动力学参数比较,发现D.radiodurans的重组酶RecA从DNA区域消除比人类的重组酶Rad51更快,但募集速率差别并不大,预示着D.radiodurans在DSB修复中的优势在于重组酶加载后的酶促反应,包括依赖模板的DNA复制和基因组重新环化速率。4.通过表达动力学参数比较,发现RecA的消除速率常数为定值,不同剂量辐射下DSB修复速率常数也近乎相等,预示着D.radiodurans不同剂量辐射下的DSB修复遵循同一个动力学过程。