胞外酸化经激活ASIC1/RIP1促进TFEB磷酸化抑制巨噬细胞脂噬

作     者：刘情 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：顾洪丰

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：酸敏感离子通道1 胞外酸化 动脉粥样硬化 脂噬 RIP1 TFEB 

摘      要：【研究背景与目的】动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)病灶处常出现酸化现象,其主要特征为局部血管内膜组织液的pH降低(pH7.0),且在脂质沉积越多的斑块核心区域pH值越低。酸敏感离子通道1(Acid-sensing ion channel1,ASIC1)蛋白对细胞外升高的H极其敏感,是转导胞外酸化信号的关键受体。我们前期研究发现,胞外酸化通过ASIC1抑制巨噬细胞胆固醇流出而促进泡沫细胞形成,但其机制尚有待进一步阐明。本研究旨在通过构建细胞外酸化诱导的巨噬细胞源性脂质蓄积细胞模型,探讨胞外酸化对巨噬细胞脂噬的影响及其机制,揭示胞外酸化通过激活ASIC1/RIP1途径促进TFEB磷酸化抑制巨噬细胞脂噬,从而减少细胞内胆固醇流出和促进脂质蓄积,为以ASIC1为靶点的AS性疾病防治提供实验依据。【方法】一、通过pH 6.5的酸性培养液与ox-LDL 25μg/m L共孵育RAW 264.7巨噬细胞24 h,模拟AS病灶中巨噬细胞所处的细胞外液酸化微环境,构建巨噬细胞源性泡沫细胞模型。油红O染色检测细胞内脂质蓄积以评价模型的建立。实验分组:pH 7.4、pH 6.5、pH 7.4+ox-LDL、pH 6.5+ox-LDL。蛋白质印迹法(Western blotting,WB)检测ASIC1、RIP1、p-RIP1、LC3、p62、p-TFEB蛋白表达,免疫荧光检测ASIC1膜转位;油红O染色检测细胞内脂质蓄积情况。二、使用PcTx-1(ASIC1特异性抑制剂),Nec-1(RIP1抑制剂)与ox-LDL25μg/m L共同孵育细胞24 h。实验分组:pH 7.4+ox-LDL、pH 6.5+ox-LDL、pH 6.5+ox-LDL+PcTx-1、pH 6.5+ox-LDL+Nec-1。WB检测ASIC1、RIP1、p-RIP1、LC3、p62、p-TFEB蛋白表达;油红O检测细胞内脂质蓄积;免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜观察脂滴(Bodipy示踪脂滴)与自噬标志物LC3II和LAMP1共定位;透射电镜观察细胞内脂滴和脂噬泡的数量;胆固醇荧光试剂盒检测ABCA1介导的胆固醇流出。【结果】1.胞外酸化促进巨噬细胞脂质蓄积。油红O实验结果表明,与pH 7.4+ox-LDL组相比较,pH 6.5+ox-LDL处理组细胞内的脂质蓄积明显增加。这表明胞外酸化促进泡沫细胞形成。2.胞外酸化抑制巨噬细胞的脂噬流。WB结果表明,与对照组相比较,胞外酸化组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显下降,p62蛋白的表达增加。3.胞外酸化促进巨噬细胞ASIC1表达与膜转位。WB结果表明,与正常pH(pH 7.4)组相比较,pH 6.5组巨噬细胞ASIC1蛋白表达增加。免疫荧光染色结果表明,正常pH组ASIC1蛋白主要位于核内,pH 6.5组ASIC1蛋白发生膜转位,其主要位于细胞质膜。4.胞外酸化促进RIP1磷酸化和TFEB磷酸化。WB结果表明,酸化环境处理组RIP1磷酸化和TFEB磷酸化水平显著增加。5.胞外酸化通过ASIC1激活RIP1促进TFEB磷酸化。使用PcTx-1和Nec-1干预处理能取消胞外酸化对ASIC1的促进作用,并抑制RIP1磷酸化和TFEB磷酸化。WB结果表明,ASIC1特异抑制剂PcTx-1处理组p-RIP1和p-TFEB蛋白水平显著减少;RIP1抑制剂Nec-1处理TFEB磷酸化水平下降。***-1和Nec-1干预能显著抑制胞外酸化诱导的巨噬细胞细胞内脂质蓄积。油红O结果显示,与对照组相比较,PcTx-1和Nec-1组巨噬细胞脂质蓄积显著减少。这些结果表明,抑制ASIC1/RIP1信号途径能拮抗胞外酸化促泡沫细胞形成的作用。***-1和Nec-1干预能显著促进胞外酸化诱导的巨噬细胞细胞脂噬流。WB结果表明,与对照组相比较,PcTx-1和Nec-1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加,而p62蛋白的水平明显减少。透射电镜观察结果显示,与对照组相比较,干预组细胞内包含脂滴的自噬体和溶酶体数量增加、而脂滴则显著减少。免疫荧光共定位、激光共聚焦显微镜结果表明,干预组细胞内脂滴与LC3共定位增加,脂滴与LAMP1共定位增加。这些结果表明,抑制ASIC1/RIP1通路能逆转胞外酸化对巨噬细胞脂噬流的抑制。***-1和Nec-1干预能促进胞外酸化诱导的巨噬细胞胆固醇流出。与对照组相比较,干预组巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1介导的胆固醇流出显著增加。【结论】1.胞外酸化抑制巨噬细胞的脂噬。2.胞外酸化经激活ASIC1/RIP1促进TFEB磷酸化抑制巨噬细胞脂噬。