人肺癌A549细胞中LASS2/TMSG1调控的凋亡相关基因和通路的全基因组转录分析

作     者：乌云嘎 

作者单位：内蒙古医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐晓艳;宣成睿

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肺癌 LASS2/TMSG1 全基因组表达谱芯片技术 MAP2K6（MEK6） MAP3K7（TAK1） p38MAPK 

摘      要：目的LASS2/TMSG1是近年来新发现的一种肿瘤转移抑制基因,研究显示其包含TLC和Homeo-domain两个保守结构域,影响着肿瘤细胞的生长、侵袭、转移、代谢、细胞凋亡、分化等。基于全基因组表达谱芯片检测技术探究人肺癌A549细胞中LASS2/TMSG1基因调控的凋亡相关基因和信号传导通路,探索基因之间的相互联系,发现影响生物体差异基因的协助脉络,并在复杂的作用链条中,系统地挖掘LASS2/TMSG1基因参与人肺癌细胞凋亡过程的作用机理。方法采用慢病毒感染实验构建LASS2/TMSG1基因沉默细胞株;采用划痕实验检测LASS2/TMSG1基因沉默对A549细胞迁移能力的影响;采用克隆形成实验检测LASS2/TMSG1基因沉默对A549细胞增殖能力的影响;采用Tunel/DAPI双染实验、Hoechst/PI双染实验检测LASS2/TMSG1基因对于A549细胞凋亡的影响;对LASS2/TMSG1基因沉默前后的人肺癌A549细胞采用全基因组表达谱芯片检测,筛选出差异基因、对差异基因和信号传导通路进行显著性分析、获得全局信号转导网络、信号通路作用网络、共表达调控网络;采用荧光实时定量PCR法和Western blot法验证全基因组表达谱芯片的一部分结果;应用小干扰RNA瞬转实验构建p3 8MAPK干扰细胞株,反向验证p3 8MAPK与LASS2/TMSG1的关系;采用SPSS22.0统计软件进行数据分析处理,两组样本均数比较采用t检验,P0.05表示两组数据差异显著,具有统计学意义。结果LASS2/TMSG1基因沉默组中的LASS2/TMSG1 mRNA及蛋白水平显著低于空白对照组、阴性对照组（荧光实时定量 PCR 法:t=3.36,P=0.028;t=5.56,P=0.005;Western blot 法:t=4.30,P=0.013;t=5.22,P=0.006）;与空白对照组、阴性对照组相比,LASS2/TMSG1基因沉默组的细胞迁移率均显著高于其他两组（t=29.72,P=0.000;t=53.06,P=0.000）;LASS2/TMSG1基因沉默组的细胞增殖能力均显著高于空白对照组、阴性对照组（t=17.20,P=0.000;t=12.27,P=0.000）;Tunel/DAPI双染实验结果显示,LASS2/TMSG1基因沉默组的凋亡率显著低于空白对照组、阴性对照组（t=3.21,P=0.033;t=4.54,P=0.011）;Hoechst/PI双染实验结果显示,LASS2/TMSG1基因沉默组的早期凋亡率显著低于空白对照组、阴性对照组（t=4.61,P=0.001;t=3.31,P=0.030）,但晚期凋亡和坏死情况三组差异不明显（晚期凋亡统计学数值:t=0.42,P=0.697;t=0.23,P=0.832;t=0.34,P=0.754;坏死情况统计学数值:t=0.74,P=0.501;t=0.44,P=0.682;t=0.96,P=0.389）;全基因组表达谱芯片检测筛选出2289个差异基因,其中上调基因1237个,下调基因1051个。上调差异基因的显著性分析主要分布在细胞分裂、核分裂、有丝分裂细胞周期的G2/M转换、细胞增殖等生物学过程,上调信号通路主要有细胞周期、DNA复制、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等;下调差异基因的显著性分析主要分布在细胞粘附、炎症反应、血管生成、ERK1和ERK2级联调节等生物学过程,下调信号通路主要有补体和凝血级联、细胞因子-细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子信号通路、自噬-动物、细胞凋亡等;全局信号转导网络显示MAP2K6（MEK6）、MAP3K7（TAK1）呈现degree值最高且下调;信号通路作用网络显示细胞凋亡信号通路degree值位列第一且下调,MAPK信号通路degree值位列第二且上调;共表达调控网络显示degree值排在前十位的为TMX3、KIF23、HMMR、WISP2、PAPPA、UACA、CDC25C、CHP1、DBF4、TOP2A,其中 UACA为抗凋亡基因与细胞凋亡相关;通过荧光实时定量PCR法和Western blot法检测LASS2/TMSG1 基因沉默组中的 MAP2K6（MEK6）、MAP3K7（TAK1）、p38MAPK的mRNA及蛋白水平均显著低于空白对照组、阴性对照组,差异有统计学意义（均P0.01,详细结果见文中结果部分）,与基因芯片结果相符;p38MAPK干扰组中的p38MAPK mRNA水平及蛋白水平均显著低于空白对照组、阴性对照组（荧光实时定量 PCR 法:t=23.46,P=0.000;t=26.09,P=0.000;Western blot 法:t=9.24,P=0.000;t=14.81,P=0.000）;p38MAPK 干扰组的 LASS2/TMSG1 mRNA 及蛋白水平亦显著低于空白对照组、阴性对照组（荧光实时定量PCR法:t=4.02,P=0.007;t=10.37,P=0.000;Western blot 法:t=3.63,P=0.022;t=4.60,P=0.010）。结论LASS2/TMSG1基因沉默促进人肺癌A549细胞的迁移和增殖能力,抑制了 A549细胞的早期凋亡;反向证明了 LASS2/TMSG1基因可能参与抑制人肺癌细胞的迁移及增殖能力,诱导肿瘤细胞凋亡。结合本课题组前期研究以及全基因组表达谱芯片分析结果,LASS2/TMSG1基因可能主要通过改变MAPK家族信号传导通路,即下调p38MAPK基因及其上游因子MAP2K6（MEK6）、MAP3K7（TAK1）来减少p38MAPK的激活,从而使p38MAPK调控的下游生物学行为（包括凋亡过程等）发生抑制。并且,本实验还筛选出差异较大的抗凋亡基因UACA,为本课题的下一步研究提供了方向。