抗菌肽-CdSe量子点的制备及抑菌活性研究

作     者：辛影 

作者单位：安徽工程大学 

学位级别：硕士

导师姓名：葛飞;张旭光

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：抗菌肽 固相合成 量子点 抗菌活性 菌血症模型 

摘      要：细菌对抗生素耐药性问题已经对人类健康产生了严重的威胁。由于抗生素的不规范使用,导致细菌耐药性威胁正在恶化。因此,研发新型抗菌药物已经迫在眉睫。抗菌肽是一种高效的、广谱的抗菌剂,通过不同的作用机制作用于病原体,具有潜在的抑菌活性,因此抗菌肽有望成为新型的治疗耐药细菌的药物。本课题通过实验,按照从美国蟑螂体内提取的多肽 Perplanetasin-4(Leu-Arg-His-Lys-Val-Tyr-Gly-Tyr-Cys-Val-Leu-Gly-Pro-NH)的氨基酸序列人工合成该抗菌肽。基于量子点具有独特光学性质,通过实验,在量子点外部用抗菌肽来修饰,大大提高了其稳定性,并且发现抗菌肽抑菌活性也得以提高,因此,抗菌肽和量子点的组合可以改善两组化合物的有效性。本课题主要开展了如下实验研究:(1)通过以2-Cl树脂为氨基酸结合的载体,采用Fmoc固相合成的方法合成粗肽,并对粗肽进行质谱分析,确定粗肽中含有目标肽,再用高效液相色谱仪进行分离提纯,获取纯度在90%以上目标产物。将得到的目标产物进行红外光谱和质谱检测,确认分离得到的肽是抗菌肽Periplanetasin-4,为接下来的实验提供了物质基础。(2)在氮气保护下将后制备Se前驱体溶液,倒入含有先制备Cd前驱体溶液的三口瓶中反应后得到CdSe NPs。然后制备AP-Cd Se NPs。用紫外分光光度计和荧光光度计对抗菌肽以及CdSe和AP-CdSe NPs者进行表征。通过分析紫外光谱图、红外光谱图以及荧光光谱图得知,抗菌肽成功修饰在CdSe量子点上,并具有荧光特性。通过电镜扫描发现AP-CdSe NPs分布均匀,CdSe粒径大小约9nm,AP-CdSe NPs粒径大小约14nm。(3)在研究AP-CdSe NPs的体内体外抑菌实验中,用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌以及MDR大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抑菌实验。抗菌肽成功修饰在CdSe量子点的表面后,对单独的抗菌肽和CdSe NPs以及AP-CdSe NPs进行体外试验。AP-CdSe NPs对普通细菌的MIC值较低,例如作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌时,AP-CdSe NPs在浓度为8.0μg/mL仍显示出较强抗菌活性。通过CFU试验发现,AP-CdSe NPs浓度为40μg/ml时,MDR大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的存活率分别为10.3%和3.8%。这些数据说明AP-CdSe NPs和单独的AP及CdSe纳米粒子相比较,其具有较高的抑菌性能。通过流式细胞术对活细胞和死细胞进行分析,探讨了细胞完整性的机制。通过GO和KEGG富集分析表明,AP-CdSe NPs由于影响细菌代谢途径近而影响了大肠杆菌的生长。这些都证实了 AP-CdSe NPs在体外有较高抗菌性能。在进行体内实验中,通过建立金黄色葡萄球菌感染小鼠的菌血症模型,进一步得出AP-CdSe NPs在体内也有较高的抑菌活性的结论,并且通过安全评估也证实AP-CdSe NPs对小鼠无毒副作用。本课题实验为以后进一步研究抗菌肽类药物制剂奠定了一定的试验基础。为以后进一步研究抗菌肽药物奠定了试验基础。