软骨细胞去分化的基因表达图谱分析与潜在标志物鉴定

作     者：凌洋 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：范长江

授予年度：2021年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：软骨细胞去分化 水凝胶 基因表达 RNA测序 

摘      要：目的软骨细胞在单层培养与传代过程中出现的去分化现象极大地限制了其功能和应用。除了少数典型的去分化标志物,目前对软骨细胞去分化的了解相对较少。本研究的目的是探究软骨细胞去分化初期基因表达的整体改变情况,对比不同的培养方法对软骨细胞基因表达的影响,借助三维(3D)水凝胶能够维持软骨细胞表型的特点鉴定软骨细胞去分化的潜在标志物。方法首先将原代软骨细胞(P0)和传代一次的软骨细胞(P1)进行形态学检测来探究单层二维(2D)培养与传代对软骨细胞形态的影响。随后将P0软骨细胞和P1软骨细胞进行高通量RNA测序(RNA-seq),比对和分析两种软骨细胞之间在转录组水平基因表达的差异,寻找软骨细胞去分化初期所涉及的信号通路以及差异表达基因。多糖水凝胶的非细胞粘附特性使其具有维持软骨细胞表型的能力,可作为一个平台与单层培养对比研究,从而鉴定去分化过程中的标志物。分别将P0软骨细胞进行2D单层培养和3D水凝胶培养(包括海藻酸钠水凝胶和HA-MA水凝胶)后对比不同培养方式对软骨细胞的影响,通过q PCR检测和免疫荧光染色来鉴定RNA-seq中发现的潜在的软骨细胞去分化标志物。结果经历过一次2D传代培养后,软骨细胞的形态从圆形或椭圆形逐渐伸展变长、细胞基因表达、细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)的组分都发生变化。我们发现去分化软骨细胞与骨关节炎(Osteoarthritis,OA)软骨细胞在转录组水平上具有相似性,包括NF-κB signaling pathway,Wnt signaling pathway和HIF-1 signaling pathway等通路的激活,以及KDM6B和PFKFB3等基因的下调。在软骨细胞去分化的初期,COL2(Type II collagen,II型胶原)出现明显的降低,COL1(Type I collagen,I型胶原)出现明显的增高,另外,P0软骨细胞的2D培养会明显提高其COL2和COL1的表达。PFKFB3、KDM6B、MEF2C在单层培养和单层传代的过程中被明显地下调,WNT5B在单层培养与传代的过程中被明显地上调。但PFKFB3、KDM6B、MEF2C和WNT5B在水凝胶培养的过程中都被有效地维持在正常表达水平。海藻酸钠水凝胶和HA-MA水凝胶都能有效地维持软骨细胞的表型,但海藻酸钠水凝胶在维持软骨细胞功能等方面优于HA-MA水凝胶。结论软骨细胞的基因表达在去分化初期已发生明显改变,结合在水凝胶中的软骨细胞3D培养,我们鉴定出PFKFB3、KDM6B、MEF2C、WNT5B等基因可能是软骨细胞去分化的潜在新型标记基因。这些结果为软骨细胞去分化提供了新的分子标志和潜在的治疗靶点。