天然产物中Kv10.1通道抑制剂发现及抗肝癌活性研究

作     者：那文静 

作者单位：河北工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：展永

授予年度：2020年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100701[医学-药物化学] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：Kv10.1通道 原花青素B1 肝癌 抑制剂 结合口袋 

摘      要：Kv10.1,也称为Eag1/KCNH1,是电压门控钾离子通道中重要的一员,也是第一个被发现具有致癌作用的离子通道。Kv10.1通道功能或表达的异常在多种肿瘤发生演化过程中出现。其中包括肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、复发和预后等。其中,肝癌由于死亡率高、预后不良的特点受到了广泛关注。有研究表明,Kv10.1通道可作为一种肝癌的标志物和抗肝癌药物作用靶点。因此,发现具有高效性、选择性、生物友好性的特征的Kv10.1通道的抑制剂,并对其开展药效研究和成药性评价具有重要的理论及应用意义。本研究首先基于Rb能够通过K通道顺浓度梯度的进入细胞,建立了一种通过Rb流出量筛选Kv10.1通道抑制剂的高通量筛选方法,初步筛选得到了一种具有抑制效果的天然化合物——原花青素B1,进一步采用电生理学方法验证了原花青素B1的Kv10.1通道抑制效果和通道特异性。在机制的研究中,一方面利用共聚焦实验检测了药物对胞内[Ca]的影响。另一方面,以鼠源Kv10.1结晶结构作为模板,同源建模得到人源Kv10.1结构后并进行分子对接,确认了原花青素B1与Kv10.1结合的主要位点并进一步利用基因定点突变实验和电生理学实验进行了验证。最后,比较分析了原花青素B1通过抑制Kv10.1功能调控正常肝细胞(L-O2)、肝癌细胞(Hep G2)细胞增殖、迁移、细胞周期和异种移植肝肿瘤增生的作用。主要的创新工作为:1、本研究首次发现由葡萄籽中提取的天然化合物——原花青素B1是Kv10.1通道的一种高效、特异性抑制剂。原花青素B1以浓度依赖性的方式抑制Kv10.1电流(IC=10.38±0.87μM),但对其他电压依赖性或非依赖性钾离子通道(包括Kir2.1,KCNQ1和HERG通道)没有抑制作用;2、确定并验证原花青素B1直接通过氢键与Kv10.1通道C-Linker结构域中I550、T552和Q557三个关键氨基酸所形成的抑制剂结合口袋结合,从而直接抑制Kv10.1通道,而不改变胞内[Ca]浓度;3、体外细胞实验和体内动物实验证明原花青素B1可以通过抑制Kv10.1通道活性从而抑制肝癌细胞的增殖、迁移和小鼠异种移植肝肿瘤(Hep G2)的生长。值得注意的是,原花青素B1既不影响正常肝细胞的生长,也不影响小鼠的正常新陈代谢。进一步证明,Kv10.1作为一个肝癌药物靶标是有潜力的。