松萝胺的抗肝癌作用机制及毒理学安全性评价

作     者：周樟屏 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：贺小琼

授予年度：2021年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：松萝胺 安全性评价 mRNAseq测序 HepG2 PRKACA PRKCB TNF信号通路 WNT信号通路 MAPK信号通路 

摘      要：[目的]松萝胺（C18H17NO6）是本课题组分离并合成的专利授权抗癌化合物。通过mRNAseq测序分析松萝胺抗肝癌作用的影响基因和信号通路,进一步通过分子对接技术分析关键基因的作用位点,从基因表达和药物作用的蛋白位点探究该化合物的抗肿瘤作用机制。采用急性毒性试验、遗传毒性试验及30d喂养试验了解松萝胺的毒作用强度和毒作用性质,初步评价该化合物的安全性。通过本研究为松萝胺的临床前研究和应用开发提供前期研究基础。[方法]以D-地衣酸与六甲基二硅胺烷为原料合成C18H17NO6,经硅胶柱层析对产物进行纯化,采用HPLC测定其纯度,获得研究样品。通过mRNAseq测序,分析松萝胺对肝癌HepG2细胞基因表达及信号通路的影响,发现松萝胺抗肝癌影响的靶基因和调节的信号通路。采用分子对接技术分析松萝胺与抗癌基因表达的PRKACA蛋白和PRKCB蛋白的结合位点。以流式细胞术检测松萝胺对HepG2细胞周期的影响。采用急性毒性试验、遗传毒性试验（体内外染色体畸变试验、骨髓微核试验和精子畸形试验）、30d重复染毒试验初步观察松萝胺的毒性。[结果]1.D-地衣酸与六甲基二硅胺烷反应可合成松萝胺（C18H17NO6）,HPLC检测显示,纯化后的C18H17NO6纯度达到97%。2.HepG2 细胞在 0.45 μmol/L、0.9 μ mol/L、1.8 μmol/L 松萝胺浓度处理下,差异性上调编码基因分别为297、132、136个,下调基因分别为236、135、151 个。3.筛选表达调节出具有剂量效应关系且文献报道具有抗癌作用的基因为CCRL2（上调）和 GPR78、CLEC2D、HOTAIR（下调）。4.0.45 μ mol/L、0.9 μ mol/L、1.8 μ mol/L 松萝胺显著性上调 HepG2 细胞 1、1、6条凋亡通路。5.松萝胺显著性上调TNF信号通路,下调WNT、非小细胞肺癌信号通路,影响MAPK信号通路,并且下调WNT\非小细胞肺癌\MAPK通路网络。6.松萝胺对PRKACA蛋白和PRKCB蛋白都有较强的亲和力,与PRKACA蛋白通过HIS142、THR299、THR300、GLU311、ASP301这5个氨基酸残基结合,与PRKCB蛋白通过THR404、ASN471、ASP470这3个氨基酸残基结合,能形成氢键来稳定结合状态。7.松萝胺能在0.25、0.5、1 μmol/L剂量下,分布于G2\M期HepG2细胞减少,并且随着剂量增加而减少。8.急性毒性试验中,在最大灌胃剂量15000mg/kg时,小鼠未出现明显毒性表现,无动物死亡。9.遗传毒性试验结果:在灌胃给予0、2000、4000、8000mg/kg松萝胺剂量下,昆明种小鼠骨髓细胞染色体畸变率分别为:雌性 3.2± 1.10%、4.4±1.67%、4.0±1.41%、2.8±1.09%,雄性 3.2±1.10%、3.2±1.79%、4.0± 1.10%、3.6±1.41%,各剂量组与阴性对照（0mg/kg）无统计学差异（P0.05）,松萝胺对昆明鼠的骨髓细胞无致染色体畸变作用。体外培养B2B细胞,在0、25、50、100 μmol/L剂量下,染色体畸变率分别为 2.4±0.89%、2.8±2.28%、4.4± 1.67%、3.2± 1.79%,各剂量组与阴性对照（0mg/kg）无统计学差异（P0.05）,松萝胺对B2B细胞无致染色体畸变作用。灌胃给予0、2000、4000、8000、15000mg/kg松萝胺剂量下,昆明种小鼠的骨髓嗜多染红细胞微核率分别为:雌性1.40±0.65‰、1.24±0.68‰、1.68±0.48‰、1.16±0.88‰、1.16±0.43‰,雄性 1.92±0.83‰、3.04±0.43‰、2.00±0.92‰、2.52±0.69‰、2.12±0.88‰,各剂量组与阴性对照（0mg/kg）比较无统计学差异（P0.05）,松萝胺无致骨髓嗜多染红细胞微核作用。灌胃给予0、2000、4000、8000、15000mg/kg松萝胺剂量下,昆明种雄性小鼠的精子畸形率分别为 1.6±0.22%、1.72±0.30%、1.82±0.47%、1.76±0.50%、2.30±0.36%,各剂量组与阴性对照（0mg/kg）无统计学差异（P0.05）,松萝胺无致精子畸形作用。10.昆明种小鼠每天经口灌胃给予2000、4000、8000mg/kg松萝胺30d,雌性小鼠8000mg/kg组和4000mg/kg组红细胞计数均显著性低于Omg/kg组（P0.05）。雄性小鼠4000mg/kg组红细胞计数、血红蛋白浓度均显著性低于Omg/kg组（P0.05）。说明松萝胺能够影响红细胞的生成。雄性小鼠在4000mg/kg和8000mg/kg剂量组的谷草转氨酶水平显著性低于Omg/kg组（P0.05）,松萝胺能够损害小鼠肝功能。雄性小鼠在8000mg/kg剂量组的血清肌酐、尿素水平显著性低于0mg/kg组（P0.05）,松萝胺能够影响小鼠肾功能。雄性小鼠在8000mg/kg剂量组的血清甘油三酯、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白水平显著性高于Omg/kg组（P0.05）;松萝胺能够影响小鼠脂质代谢功能。雌性小鼠在8000mg/kg组葡萄糖水平显著性低于0mg/kg组（P.0.05）,松萝胺能够影响小鼠糖代谢功能。病理学检查均未见小鼠肝、肾、睾丸的明显病理改变。[结论]1.松萝胺能采用化学手段进行合成,易于纯化。2.C18H17NO6能够显著性调节HepG2细胞基因和信号通路。3.CCRL2、GPR78、CLEC2D、HOTAIR是松萝胺抗肝癌的靶基因。4.松萝胺显著性影响TNF信号通路、WNT通路和非小细胞肺癌通路。这些通路的调节有利于抗肿瘤作用。5.C18H17NO6与WNT通路的PRKACA蛋白和PRKCB蛋白结合紧密,发挥抗癌作用。6.C18H17NO6经口急性毒性无毒。7.C18H17NO6在本研究中未见明显遗传毒性。8.短期重复给药试验,松萝胺能影响小鼠肝肾功能和血糖血脂代谢,并且存在性别差异。肝、肾、睾丸未见明显病理学改变。