基于PI3K/Akt/mTOR通路介导的羟基红花黄色素诱导H22肝癌细胞凋亡和自噬的研究

作     者：谭荣荣 

作者单位：江西中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王晓敏

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：HSYA 凋亡 自噬 LC3 PI3K Akt mTOR 

摘      要：目的:探讨羟基红花黄色素(Hydroxysafflor yellow,HSYA)对H22肝癌细胞的抑制作用及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路相关蛋白的影响。方法:1.制备H22肝癌模型及分组给药:昆明种雄性小鼠48只,SPF(Specific Pathogen Free,SPF)级,取8只作为空白对照组,其余小鼠在其皮下注射H22肝癌细胞建立H22肝癌小鼠模型。接种24 h后,随机分为模型对照组、HSYA低、中、高剂量组、阳性对照组,每组8只。HSYA低、中、高剂量组(20、40、60 mg·kg·d)剂量腹腔注射用药,每只0.2 mL,每日1次;阳性对照组环磷酰胺25 mg·kg·d剂量腹腔注射用药,每只0.2 mL,隔日一次;模型对照组和空白对照组0.2 mL生理盐水腹腔注射,每日1次。观察小鼠的一般状况及体重,连续用药14天后处死小鼠称重。2.浸水法测量肿瘤组织的体积。3.肿瘤组织及脾脏称重,测量瘤质量,计算脾指数及抑瘤率。4.苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察肿瘤组织形态变化。5.末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测H22细胞的凋亡。6.免疫组化法和蛋白免疫印记法(Western-bloting)检测自噬体膜标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain3,LC3)蛋白水平。7.免疫组化法和Western-bloting法检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达。结果:***对H22肝癌小鼠的一般状态及体重的影响:模型对照组小鼠精神欠佳,毛发较光滑,进食进水、活动量减少,体重增加;HSYA低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠精神状态较好,毛发光滑,进食进水、活动量增多,体重低于模型对照组(P0.05)。***对H22肝癌小鼠瘤体积的影响:HSYA低、中、高剂量组和阳性对照组小鼠肿瘤体积均小于模型对照组(P0.05)。***对H22肝癌小鼠瘤质量、脾指数及抑瘤率的影响:模型对照组瘤质量较大,HSYA低、中、高剂量组和阳性对照组瘤质量均有所减轻(P0.05),其中HSYA高剂量组瘤质量明显减轻(P0.01)。空白对照组和模型对照组脾指数较大,HSYA低、中、高剂量组和阳性对照组脾指数均有所下降(P0.05)。HSYA低、中、高剂量组、阳性对照组肿瘤率分别为32.01%、39.82%、44.51%、73.64%。***对H22肝癌小鼠病理形态的影响:模型对照组肿瘤细胞密集,数量多且排列紊乱,核分裂现象多,核深色染,核浆比例高,异型性显著,与周边组织分界模糊,已侵袭周边肌肉组织;HSYA低剂量组肿瘤细胞聚集,细胞数量多且排列紊乱,核染色深,核浆比较大,异型性显著;HSYA中剂量组肿瘤细胞数量减少,局部肿瘤区域有坏死;HSYA高剂量组肿瘤细胞明显减少,巨核、多核肿瘤细胞少见,核染色较浅,与周边组织分界清楚,肿瘤组织呈大片坏死;阳性对照组肿瘤细胞明显减少,核染色浅,异型性不明显,与周边组织分界清楚,未侵犯到周边组织,大部分区域可见肿瘤组织坏死。***对H22肝癌细胞凋亡水平的影响:模型对照组凋亡细胞较少,HSYA低、中、高剂量组和阳性对照组凋亡细胞明显增加(P0.05)。***对H22肝癌细胞自噬体膜标志蛋白LC3蛋白表达的影响:模型对照组肿瘤细胞LC3蛋白表达较少,HSYA低、中、高剂量组和阳性对照组LC3蛋白表达明显增多(P0.01)。***对H22肝癌细胞PI3K/Akt/mTOR通路的影响:与模型对照组相比较,免疫组化和Western-bloting结果均提示HSYA低、中、高剂量组和阳性对照组肿瘤细胞的PI3K,Akt,mTOR蛋白表达明显减少(P0.01)。Western-bloting结果提示:与模型对照组相比较,HSYA低、中、高剂量组和阳性对照组肿瘤细胞的P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR蛋白表达明显减少(P0.05)。结论:HSYA对H22肝癌细胞具有抑制作用;其抑制作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡和自噬有关;其机制可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导其凋亡和自噬。