伤寒沙门菌Vi荚膜多糖影响巨噬细胞凋亡及TRAIL通路的机制研究

作     者：尹芬芬 

作者单位：江苏大学 

学位级别：硕士

导师姓名：生秀梅

授予年度：2021年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：伤寒沙门菌 巨噬细胞 凋亡 Vi荚膜多糖 TRAIL通路 

摘      要：目的:巨噬细胞是伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi,***）感染过程中主要的宿主细胞,本研究通过***感染经PMA诱导的THP-1细胞,探究***及其毒力因子Vi荚膜多糖对巨噬细胞凋亡及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）信号通路的影响。方法:1.转录组测序:***野生株WT感染THP-1细胞0 h、4 h和26 h,提取巨噬细胞RNA进行转录组测序（RNA-seq）。***-seq数据整理及分析:筛选出RNA-seq结果中与细胞凋亡相关且存在变化的数据,通过定量PCR（quantitative PCR,q PCR）技术分析***感染THP-1细胞早期和晚期凋亡相关基因的表达水平。***感染THP-1细胞后细胞凋亡的检测:***感染THP-1细胞0 h、6 h和24 h,流式细胞术检测THP-1细胞凋亡率,western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的剪切水平。***感染THP-1细胞后TRAIL信号通路的检测:***感染THP-1细胞0 h、6 h和24 h,western blot检测TRAIL信号通路中配体TRAIL和死亡受体DR5的蛋白表达水平;外源加入TRAIL抗体中和TRAIL蛋白,western blot检测WT感染细胞6 h Caspase-3蛋白的剪切水平,流式细胞术检测THP-1细胞凋亡率的变化。***感染THP-1细胞后Vi荚膜多糖表达水平的检测:***感染THP-1细胞2 h和24 h,提取RNA通过q PCR技术检测Vi相关基因tvi A、tvi B的表达变化。***缺陷株感染THP-1细胞后细胞凋亡的检测:*** Vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）和WT感染THP-1细胞6 h和24 h,western blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的剪切水平,流式细胞术检测THP-1细胞凋亡率。***缺陷株感染THP-1细胞后TRAIL信号通路的检测:*** Vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）和WT感染THP-1细胞6 h和24 h,western blot检测TRAIL信号通路中配体TRAIL和死亡受体DR5的蛋白表达变化。Vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）和WT感染细胞1 h、2 h和24 h,q PCR技术分析Tnfsf10（编码TRAIL蛋白）、Tnfrsf10b（编码DR5蛋白）基因的表达水平。外源加入TRAIL抗体中和TRAIL蛋白,western blot检测Δvex E感染细胞6 h Caspase-3蛋白的剪切水平,流式细胞术检测THP-1细胞凋亡率的变化。结果:1.筛选出RNA-seq结果中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等12个凋亡相关基因,整理后进行分析,q PCR分析结果与RNA-seq结果基本一致。***感染THP-1细胞后,细胞凋亡率明显高于未感染细胞组（p0.05）,凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9激活明显增加,蛋白经剪切后的条带明显强于未感染细胞组,且感染晚期细胞凋亡较早期增加（p0.05）,细胞凋亡呈现动态变化。***感染THP-1细胞后,TRAIL信号通路中配体TRAIL和死亡受体DR5的蛋白表达较未感染时明显增加,且随感染时间增加蛋白条带增强;加入TRAIL抗体处理后,Caspase-3蛋白激活减少,剪切条带明显减弱,凋亡的巨噬细胞数量明显减少（p0.05）。***感染THP-1细胞早期Vi相关基因tvi A、tvi B转录水平表达较高,感染晚期Vi表达有所下降（p0.05）。5.与WT感染相比,Vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）感染THP-1细胞6 h和24 h,凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的激活均显著增加,剪切条带明显增强,细胞凋亡率增加（p0.05）。6.与WT感染相比,Vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）感染THP-1细胞6 h和24 h,配体蛋白TRAIL表现出显著的表达上调,受体蛋白DR5未有明显变化。7.与WT感染相比,Vi缺陷株（Δtvi A、Δvex E、Δtvi B-vex E）感染THP-1细胞1 h,Tnfsf10基因均