基于荧光衍生化纳豆中DL-氨基酸检测新方法及朝药鹿茸大补汤药效物质基础研究

作     者：金阅莹 

作者单位：延边大学 

学位级别：硕士

导师姓名：闵俊哲

授予年度：2021年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 1005[医学-中医学] 100513[医学-民族医学(含：藏医学、蒙医学等)] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：纳豆 DL-氨基酸 鹿茸大补汤 药效物质基础 UHPLC-MS/MS 

摘      要：纳豆作为一种溶栓降脂、软化血管、防止动脉硬化的功能性保健食品备受关注。蒸熟大豆在枯草芽孢杆菌作用下发酵形成纳豆过程中会释放游离氨基酸,近年来,在纳豆黏液中发现了D-谷氨酸。但对纳豆中其他手性氨基酸的存在及功能还未见相关报道。因此本研究使用自行研制的新型手性荧光衍生化试剂DBD-trans-2-methyl-L-proline(DBD-M-Pro),基于超高效液相色谱(UPLC)-荧光(FL)检测技术建立了柱前荧光衍生化同时分析纳豆中游离DL-氨基酸的新方法,并应用于不同厂家纳豆的豆和黏液的分析。DBD-M-Pro与DL-氨基酸在60°C下反应60分钟生成非对映体,使用BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱,在激发波长(Ex):450 nm,荧光波长(Em):560 nm处对非对映体进行了检测。结果4种DL-氨基酸(Gln,Asp,Glu,Ala)在20分钟内分离度(Rs)为1.65-3.50,达到完全分离。检测限为0.25-2.5 pmol。在三种不同厂家纳豆的豆和黏液中均检测到4种DL-氨基酸,且纳豆黏液中DL-Gln,DL-Glu,DL-Ala三种氨基酸的含量明显高于豆中的含量。另外可使用D/L-Gln,D/L-Asp的峰面积比值鉴别不同生产厂家。中国朝医学是朝鲜民族通过长期与疾病作斗争得出的理论与经验。其中“鹿茸大补汤(LRDBT)是朝医药的经典名方,由鹿茸、麻黄、五味子、杏仁、天冬、麦冬、山药、薏苡仁等8味药组成,在临床上对太阴人哮喘具有明显改善症状及治疗作用。然而由于“鹿茸大补汤的药效物质成分及体内作用机理尚不明确,因此本研究使用高分辨UHPLC-QE-Orbitrap-MS技术,结合Compound Discoverer(CD)小分子化合物分析平台及标准品对“鹿茸大补汤药效物质基础进行了研究。通过CD分析,比较保留时间和二级质谱(MS/MS)碎裂模式,在“鹿茸大补汤中初步鉴定出86种化合物,包括生物碱类、黄酮类、酰胺类、氨基酸等。其中有12个化合物使用标准品进一步进行了结构确证,分别为苦杏仁苷、苹果酸、柚皮素、儿茶素、腺苷、甜菜碱、鸟嘌呤、脯氨酸、组氨酸、DL-哌啶甲酸、尿嘧啶核苷酸、次黄嘌呤。为更好地解释药效成分的来源,还检测了“鹿茸大补汤单味药的物质基础成分,并进行了比对及筛查。本研究建立了两种新的检测方法,首先基于新型荧光手性衍生试剂DBD-M-Pro柱前衍生化,建立了同时检测纳豆中4种DL-手性氨基酸的新方法。首次在纳豆和黏液中发现了4种游离DL-氨基酸,为纳豆新保健功能的研究和质量控制提供了可靠、简便的分析方法。其次,本研究首次建立了基于UHPLC-MS/MS技术,鉴定“鹿茸大补汤中药效物质基础成分的新方法,为进一步研究体内代谢通路及药物作用靶点提供了一种有效的方法和基础数据。