早期胚胎停止发育绒毛组织mRNA m6A甲基化修饰及表达谱研究

作     者：黄娜娜 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：廖世秀

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：胚胎停止发育 绒毛组织 滋养层细胞 m6A甲基化 mRNA 

摘      要：背景妊娠早期胚胎停止发育是一种常见的病理性妊娠,属于自然流产(Spontaneous abortion,SA)的一种特殊形式。普遍的临床观点认为,SA是由一系列亚临床疾病(解剖异常、内分泌改变、血栓形成、潜伏感染和免疫失调等)引起,处于“脆弱的早孕状态,从而流产。除此之外仍有约一半的复发性流产(Recurrent spontaneous abortion,RSA)未查明原因,病因缺乏相关信息无疑限制了孕前指导及治疗。已有研究表明表观遗传学改变在胚胎发育、胎盘功能及生殖系统疾病中发挥关键作用。近年来作为表观遗传学研究领域研究较为火热的RNA修饰的一种,m6A甲基化不仅在肿瘤研究中呈爆炸式增长,同时也提示可能与生殖细胞及胚胎发育相关。其中,RSA绒毛组织中m6A修饰的mRNA整体表达谱尚未见报道。目的本研究旨在系统分析早期不明原因胚胎停止发育绒毛组织中m6A甲基化修饰模式和mRNA的表达谱变化,构建不明原因胚胎停止发育绒毛组织m6A修饰的mRNA图谱。并将mRNA表达与m6A甲基化修饰进行联合分析,探索m6A甲基化修饰在早期不明原因胚胎停止发育发生机制中的作用。方法(1)招募2019年6月到2020年8月在郑州大学人民医院因不明原因多次胚胎停育清宫患者(RSA组)及自愿终止妊娠的正常早孕患者(NC组)。各收集其流产绒毛组3g,液氮速冻后,-80℃保存。(2)两组绒毛组织总RNA均使用Trizol法提取,质检合格后置于-80℃冰箱保存。RNA分成两份,一部分构建转录组测序文库,另一部分行m6A特异性抗体富集后进行Me RIP-seq文库构建。质检合格的文库测序。对测序数据进行质控和初步分析。(3)Me RIP-seq后筛选差异peak,并对差异peak相关基因进行GO与KEGG功能富集分析。RNA-seq后所得数据进行归一化和差异分析,筛选出显著差异基因进行火山图及聚类热图分析,并进行DO、GO及KEGG功能富集分析。以上均以FDR1作为筛选条件。(4)Me RIP-seq和RNA-seq数据联合分析。筛选出m6A修饰水平及mRNA表达水平同时显著变化的基因,并对差异基因进行GO富集、KO富集分析。(5)对m6A调节剂METTL3、HNRNPC和筛选出的6个m6A修饰水平及mRNA表达水平同时显著变化的基因进行RT-q PCR验证。(6)通过SPSS22.0软件和Graph Pad Prism 7.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准误(M±SD),RSA组及NC组之间比较采用t检验,P1的筛选标准,共筛选出138个显著差异的peak,其中RSA组相比于NC组m6A修饰上调peak 101个,m6A修饰下调peak 37个。差异peak相关基因KO分析显示显著富集通路主要有Toll样受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、NOD样受体信号通路、单纯疱疹病毒感染和凋亡等。(3)RNA-seq检测到的总20286个mRNA相关基因中,按照P1的筛选标准,共筛出3574个显著差异基因,分别包括2720个表达显著上调基因及854个表达显著下调基因。这些显著差异基因主要富集的与女性生殖系统相关的DO条目有胚胎发育、绒毛膜癌、子痫前期、不孕不育等;KO分析显著富集的pathway分别有Th17细胞分化、Ras信号通路、Jak-STAT信号通路、癌症相关通路、抗叶酸、细胞凋亡等。(4)Me RIP-seq与RNA-seq联合分析,以P1为筛选条件,共筛选出65个m6A修饰显著差异且mRNA水平显著变化的基因。(5)m6A甲基化调节剂“writersMETTL3及“readersHNRNPC表达显著下调(P0.01),其余调节剂表达均无显著变化。(6)RT-q PCR验证,除EMILIN1验证结果差异不显著外,其余基因METTL3、HNRNPC、MTR、LGI2、ZBTB4、TFAP4和PLSCR3均与mRNA测序结果一致(P0.05)。结论(1)人绒毛组织中m6A甲基化调节剂所结合的motif基序和m6A修饰功能区域与其他物种一致,具有保守性。(2)m6A甲基化在早期胚胎停止发育绒毛组织中具有差异性修饰。(3)m6A修饰异常导致至少一部分mRNA表达水平显著变化,可能会引起RSA患者绒毛组织增殖减弱、植入不足、凋亡增加,从而造成早期胚胎的停止发育和死亡。(4)我们的研究描绘了早期胚胎停止发育绒毛组织的m6A甲基化修饰图谱,为探索RSA患者胚胎停止发育机制提供新的视角。