水稻AFP家族的生物信息学分析和afp1突变体耐逆性研究

作     者：周天顺 

作者单位：湖南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：袁定阳

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：水稻（Oryza sativa L.） AFP基因家族 生物信息学分析 AFP1（MODD） CRISPR/Cas9基因编辑技术 耐逆性 

摘      要：非生物胁迫是阻碍作物生长发育、生存繁殖的主要因素之一,选育高抗性品种是降低非生物胁迫对作物危害的最有效途径。因此,如何高效创新高抗性种质资源成为育种家的研究热点。AFP家族基因通过ABA信号途径广泛参与植物非生物胁迫响应,而水稻AFP基因的功能研究较少。因此,分离鉴定水稻AFP逆境响应基因,并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术快速创制抗逆新种质对于水稻抗性改良具有重要意义。本研究利用生物信息学方法对水稻AFP基因进行了全基因组鉴定,并系统分析了AFP家族成员的进化关系、保守性、自然变异和表达模式等;利用CRISPR/Cas9技术对胁迫响应基因AFP1（MODD）进行了定向突变,分析了CRISPR/Cas9技术的编辑效率,afp1突变体的突变类型、遗传特征、脱靶情况及农艺性状等;最后对突变体的耐逆性进行了研究。主要结果如下:（1）从水稻基因组中鉴定到3个AFP基因,Os AFP1和Os AFP2分布在Chr3上,而Os AFP3位于Chr7上。家族成员之间的等电点、疏水性和稳定系数相似,基因结构和基序分布保守性高;AFPs可能起源于单双子叶植物分化之后,片段复制和全基因组复制是AFP扩张的主要方式;AFPs均在生殖生长阶段高表达,其启动子区域含有多种胁迫和激素响应顺式作用原件,且受多种激素和胁迫处理的诱导,表明AFP家族基因可能参与水稻生长发育和多种胁迫抗性的调控;不同品种AFP基因之间存在大量SNP和In Del,有8个有较大可能产生功能差异的自然变异位点,其中3个具有明显的籼粳差异。（2）在AFP1基因5’端CDs区域设计两个靶位点,构建了AFP1基因的敲除载体MT-AFP1,并获得12株T0代阳性转基因植株;靶点1和靶点2的编辑效率分别为66.67%和75.00%;突变类型仅有插入和缺失突变,突变长度主要为小片段（5bp）,突变位置主要为PAM结构上游第三和第四个碱基之间;创制的突变体是可遗传的,且后代分离符合经典孟德尔遗传;无外源基因的纯合突变体KO1-KO6中的潜在脱靶位点均未出现脱靶现象;表型分析表明,和野生型相比,afp1突变体株高和结实率降低,生育期稍微提前,有效分蘖和穗长显著升高,单株产量呈现不同的变化趋势;此外,afp1突变体中AFP1基因的表达量显著下调,而AFP1抑制基因Osb ZIP46表达量显著上调。这些结果表明CRISPR/Cas9技术能够快速精准高效的创制水稻新种质资源。（3）3μM ABA处理时,afp1敲除突变体萌发期的种子萌发率显著降低,而幼苗期植株株高和根长显著缩短;干旱处理时,afp1突变体幼苗的存活率显著提高,叶片的水分散失率显著降低;150m M甘露醇处理时,突变体的株高和根长显著高于野生型;而盐胁迫和冷胁迫条件下,突变体和野生型存活率无显著差异;高温胁迫处理后,突变体的绿叶面积和生长状况明显好于野生型;这些结果表明,突变AFP1基因提高了水稻多种非生物胁迫耐逆性。