PRRSV再感染诱导猪IL-4体外细胞共培养表达系统及小鼠模型构建

作     者：庞恒 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：彭军

授予年度：2021年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪繁殖与呼吸综合征病毒 再感染 细胞共培养 白细胞介素4 

摘      要：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)俗称“蓝耳病,对全球经济有着严重的影响,PRRSV感染对仔猪的先天免疫力和适应性免疫力均会造成损害。已有研究证实:仔猪首次感染PRRSV后,首次感染组仔猪与阴性对照组IL-4表达水平无显著性差异;再次感染后,再次感染组仔猪与首次感染、阴性对照组IL-4表达水平均存在显著性差异(p0.05)。本实验室成功验证上述规律并发现IL-4在外周免疫器官中的“迁移现象,即首次感染后淋巴结中IL-4分散于淋巴小结外围,再次感染后淋巴结中IL-4聚集于B淋巴细胞周围。基于探索IL-4分泌的特殊规律;解释IL-4在生发中心的迁移现象;筛选诱导IL-4表达的PRRSV蛋白,因此亟需构建PRRSV再感染诱导IL-4分泌的体外细胞共培养表达系统与小鼠模型。仔猪首免试验:用JXA1-R株免疫4周龄仔猪,于首免后21d、42d、84d分选PBMCs,评估CD4T细胞比例、淋巴细胞转化率、IL-4体外表达水平。体外细胞共培养试验:接种JXA1病毒于mPAM-CD163后,与首免后PBMCs进行细胞共培养,完成体外再次感染。通过体外细胞共培养再感染PRRSV模型对MOI、病毒感染时间、细胞比例、细胞共培养时间进行筛选,构建体外细胞共培养系统。并对该系统下mPAM-CD163与CD4T细胞相互作用关系进行初步探索。小鼠模型试验:SPF级C57雌鼠分三组,PBS组、首次免疫组、再次免疫组,试验0d首次免疫JXA1-R,试验14d再次免疫JXA1。于0、7、14、28 dpi收集血清,测定IL-4表达水平;同时采集各器官、检查病理变化、统计脏器系数;检测PRRSV病毒复制水平;逐日记录小鼠精神状态、临床症状、体重比;对7、14、28 dpi脾脏进行HE染色,观察脾小结病理变化。仔猪首免试验结果显示:仔猪首免42、84 dpi,PBMCs中CD4T细胞比例为12%、10%;21、42、84 dpi外周血淋巴细胞转化率为32%、22%、20%;42、84 dpi PBMCs体外培养18h后IL-4浓度为60、70 pg/m L。体外细胞共培养试验结果显示:MOI=0.01、病毒感染1h、细胞比例1:5、共培养18h条件下,体外再感染组IL-4表达水平显著高于体外未感染组(p0.05)。本试验成功构建了PRRSV再感染诱导猪IL-4分泌的体外细胞共培养表达系统。该系统下,体外再感染组中大量CD4T细胞与mPAM-CD163发生相互结合,而体外未感染组中CD4T细胞与mPAM-CD163未发生相互结合。小鼠模型试验结果显示:14 dpi首次免疫组小鼠血清中IL-4表达水平显著高于其余试验组(p0.01);首次免疫组与再次免疫组中均未检测到PRRSV发生复制;14 dpi首次免疫组小鼠脾脏中脾小结数量较多,形状最大,均匀分布;本试验初步建立了PRRSV诱导IL-4表达的小鼠模型。