FPS-ZM1对高糖诱导下骨髓间充质干细胞炎症因子表达的影响及相关机制研究

作     者：蒋孟佚 

作者单位：西南医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭玲

授予年度：2021年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：FPS-ZM1 高糖 骨髓间充质干细胞 炎症 TXNIP/NLRP3信号通路 

摘      要：第一部分FPS-ZM1对高糖诱导下骨髓间充质干细胞增殖以及晚期糖基化终末产物受体表达的影响目的:研究晚期糖基化终末产物受体（Receptor for advanced glycation end-products,RAGE）特异性拮抗剂FPS-ZM1在高糖诱导的条件下对骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）增殖的影响,探究后续试验所需FPS-ZM1的最适浓度以及药物作用时间;进一步探究骨髓间充质干细胞处于高糖环境中RAGE表达的变化,随后在FPS-ZM1作用的细胞中探究RAGE表达水平的改变。以寻找拮抗高糖对骨髓间充质干细胞致炎作用的新靶点,可为糖尿病相关性牙周炎及种植体周围炎的预防和治疗提供新的思路。方法:使用高糖培养基在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,以建立高糖环境体外细胞培养模型。将骨髓间充质干细胞传代培养至第三代,取生长状况良好的细胞随机分组,换新鲜高糖培养基培养24 h后加入浓度不同的RAGE抑制剂FPS-ZM1（250 n M,500 n M,750 n M）,并设置低糖培养、未加FPS-ZM1的细胞组作为空白对照;设置高糖培养、未加FPS-ZM1的细胞组作为阳性对照。使用CCK-8法（Cell Counting Kit-8）检测细胞增殖能力;并使用Western-blot法检测高糖培养组以及FPS-ZM1和高糖共培养组中骨髓间充质干细胞表达RAGE蛋白的变化。结果:骨髓间充质干细胞在高糖诱导下的增殖能力相较于空白对照组而言是显著升高的（P0.05）,在48 h时间点增殖率是为峰值,但是增值率的增长随高糖作用的时间延长而显著下降。低浓度FPS-ZM1与高糖共作用（250 n M FPS-ZM1+HG）对骨髓间充质干细胞增殖相比高糖组（HG组）无明显影响（P0.05）,中、高浓度的FPS-ZM1减轻了骨髓间充质干细胞在高糖环境中的增殖上升,但高糖+500 n M FPS-ZM1和高糖+750 n M FPS-ZM1组别之间的作用没有显著差异（P0.05）。此外,高糖可以显著刺激骨髓间充质干细胞中的RAGE蛋白表达水平上调,这种作用能被FPS-ZM1抑制。结论:500 nM浓度的FPS-ZM1宜作为后续一系列试验的药物浓度,另外48 h宜作为后续药物作用的最适宜时间。此外,高糖可以显著刺激骨髓间充质干细胞中的RAGE蛋白表达水平上调,而FPS-ZM1作用能够抑制细胞中的RAGE激活,这表明骨髓间充质干细胞受到高糖刺激后可能激活了RAGE介导的一系列细胞内信号转导,而FPS-ZM1对受到高糖刺激后的骨髓间充质干细胞有显著有效的RAGE靶点封锁作用,FPS-ZM1可能成为削弱高糖诱导的牙周组织或种植体周围炎症反应的另一途径。第二部分FPS-ZM1减轻高糖诱导下骨髓间充质干细胞炎症反应及相关机制研究目的:探究特异性晚期糖基化终末产物受体拮抗剂FPS-ZM1调控高糖环境中骨髓间充质干细胞炎性反应的作用,进一步探讨TXNIP/NLRP3（Thioredoxin-interacting protein/NLR family,pyrin domain containing protein 3）炎性小体信号通路在FPS-ZM1调控炎症中的相关作用。方法:在体外使用高糖培养基培养大鼠骨髓间充质干细胞,以建立高糖环境体外细胞培养模型。将骨髓间充质干细胞传代培养至第3-6代,取生长状况良好的细胞随机分组,换新鲜高糖培养基培养24 h后随即将细胞分为DMEM/low glucose培养组（NG组）、DMEM/high glucose培养组（HG组）、DMEM/high glucose培养基+FPS-ZM1组（HG+FZ组）以及DMEM/high glucose培养基+TXNIP/NLRP3信号通路抑制剂白藜芦醇（Resveratrol,Res）组（HG+Res组）,用RT-q PCR和Western-blot检测硫氧还蛋白互作蛋白TXNIP,硫氧还蛋白（thioredoxin protein,TRX）,半胱氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1）,NLRP3以及凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-related speck-like protein containing CARD,ASC）的基因和蛋白表达水平。采用ELISA法检测白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白介素6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）炎性因子的表达。结果:骨髓间充质干细胞暴露在高糖刺激后能激活细胞炎性因子TNF-α,IL