波棱瓜性别鉴定的RAPD和SCAR分子标记研究

作     者：谢坤 

作者单位：成都大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵琦

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：波棱瓜 性别鉴定 RAPD SCAR 

摘      要：目的波棱瓜为雌雄异株一年生草本植物,是一种种植在四川甘孜、阿坝地区的传统藏药,具有清热解毒、柔肝等功效,现代医学证明波棱瓜对乙肝有一定功效极具临床医用价值。作为一种以种子为药用材料的雌雄异株植物,在生产实践中,波棱瓜雌株的利用价值更大,但其在开花前采用形态学和生理学方法很难分辨性别,因此本研究利用RAPD和SCAR分子标记技术研究与波棱瓜性别研究相关的分子标记。方法以成年已知性别波棱瓜DNA为模板,利用单因素梯度对波棱瓜RAPD体系进行PCR优化,筛选出背景干净、条带清晰明亮、无拖尾的引物,剔除无法对波棱瓜扩增以及扩增效果差的引物;分别以波棱瓜雌雄样品池的混样作为模板,对有效引物再做进一步筛选,选出能在雌雄样品池中扩增出有差异性片段的引物;分别用组成雌雄样品池的单样对雌雄样品池间有差异的引物进行验证,找出与波棱瓜性别差异相关的RAPD分子标记;利用分子生物学技术克隆与波棱瓜性别差异相关的RAPD分子标记特异片段,通过Prime5软件设计SCAR引物验证波棱瓜RAPD-SCAR分子标记的有效性。结果(1)通过单因素梯度实验确定20μl的RAPD-PCR体系为:10×buffer 2μl,浓度为1μmol/L的RAPD引物0.80μl,浓度为1.25-20ng/μl的模板DNA 2μl,浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶4μl,dd HO余量。(2)以所获得的RAPD-PCR最优反应体系对312条RAPD引物进行筛选,确定引物S94和S15可稳定扩增出与波棱瓜性别相关的特异性条带。(3)通过测序获得S94所扩增出的条带序列,并以此条带设计SCAR引物,可在雌性单株中稳定扩增出一条大小为423bp的特异性条带(S15相关的SCAR引物转化失败,S94相关SCAR标记转化成功)。结论本研究获得的1个与雌性性别相关的SCAR分子标记实现了对不同性别波棱瓜的快速、准确的鉴定,今后将用于鉴定苗期性别未知的植株以及大规模种质材料的检测,从而为波棱瓜早期性别鉴定提供基础。