动物性食品中酰胺醇类药物残留的免疫分析方法研究

作     者：赵粉粉 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：米铁军

授予年度：2021年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：酰胺醇类 酶联免疫分析 免疫层析 荧光偏振免疫分析 

摘      要：酰胺醇类抗生素主要包括氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)和氟苯尼考(FF),因它们较好的药代动力学和抗菌特性,常被用于畜牧生产和水产养殖中,但酰胺醇类部分药物残留于动物性食品中会直接威胁人体健康或使环境中耐药菌增加。随着各国对酰胺醇类药物残留监管力度的增加,探索更加精确、灵敏及高效的药物残留检测方法已成为大势所趋。其中免疫分析检测技术因其特异性强、灵敏度高、操作简便等优点常用于检测动物性食品中酰胺醇类药物残留。目的:通过酶联免疫检测技术(ELISA)、免疫层析试验(ICT)及荧光偏振免疫分析(FPIA)等检测技术,建立酰胺醇类药物在动物性食品中的残留检测方法,实现动物性食品中酰胺醇类多残留检测。方法:在紫外鉴定完全抗原合成成功的基础上,建立间接ELISA方法,同时对反应条件进行优化,建立标准曲线。通过对比选择单抗识别能力最强的包被原,对方法特异性和灵敏度进行测定;通过建立免疫层析分析方法,对牛奶中酰胺醇类残留进行可视化检测;制备和筛选酰胺醇类药物荧光标记物,建立荧光偏振免疫检测方法。结果:(1)紫外光谱法对人工抗原鉴定结果表明,成功合成5种半抗原和8种包被原TAP-Gly-BSA(2种)、TAP-HS-BSA、TAP-NH-BSA、CAP-HS-BSA、CAP-NH-GA-BSA、FF-HS-BSA、FF-NH-BSA。(2)实验室获得CAP、FF、TAP 3种单克隆抗体,在此基础上进行间接竞争ELISA检测。以抗原TAP-Gly-BSA(EDC)和CAP单抗与FF和TAP做交叉反应,测得CAP单抗与FF和TAP的交叉反应率(CR%)分别为0.025%和0.066%;以抗原FF-NH-BSA和TAP单抗与CAP和FF做交叉反应,测得TAP单抗与CAP无交叉反应与FF的交叉反应率(CR%)为114.7%;以抗原FF-HS-BSA和FF单抗与CAP和TAP做交叉反应,测得FF单抗与CAP和TAP的交叉反应率(CR%)分别为0.086%和25%。(3)优化ICT检测条件后进行酰胺醇类免疫层析多残留检测,最终确定所建立的多残留胶体金免疫层析方法在牛奶样品中的Cut-off值(临界值),其中CAP为0.5 ng·m L,FF为5 ng·m L,TAP为5 ng·m L。胶体碳免疫层析方法在牛奶样品中的CAP Cut-off值为0.1ng·m L,FF为1ng·m L,TAP为1 ng·m L。(4)成功合成和筛选出适用于FPIA检测的荧光标记物,建立了FPIA检测方法,在硼酸盐缓冲液中对CAP、FF和TAP的IC分别为4.085·ng m L、7.04ng·m L、16.31 ng·m L。结论:通过ELISA方法比较不同抗原对抗体灵敏度的影响,筛选出对抗体灵敏度较高的异源性抗原,为提高酰胺醇类残留检测方法灵敏度提供参考依据;建立胶体金和胶体碳免疫层析检测方法,实现了牛奶中酰胺醇类残留的可视化检测;初步建立了FPIA检测方法,为实现动物性食品中酰胺醇类快速多残留检测奠定了基础。