属间重组真菌免疫调节蛋白（FIP-SJ75）表达及生物活性研究

作     者：邵科迪 

作者单位：上海交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周选围;鲍大鹏

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 10[医学] 

主      题：真菌免疫调节蛋白 大肠杆菌表达系统 人类肝癌细胞HepG2 小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7 炎症基因 

摘      要：真菌免疫调节蛋白（fungal immunomodulatory proteins,FIPs）是一类来自于食药用真菌,具有高度序列和结构相似性的具有生物活性的小分子蛋白。FIPs具有广泛的生物活性功能,如:抗肿瘤、抗过敏、促进免疫细胞增殖、调节细胞因子等。随着人们对其食药用特性的研究兴趣不断提高,建立一套能够高效表达可溶性FIPs和清楚研究其生物活性基本机制的方法至关重要。本论文以通过DNA shuffling技术属间重组得到的新基因FIP-SJ75和赤芝（Ganoderma lucidum）免疫调节蛋白基因FIP-glu、金针菇（Flammulina velutipes）免疫调节蛋白基因FIP-fve、草菇（Volvariella volvacea）免疫调节蛋白基因FIP-vvo为材料,成功构建了pCold TF::FIP-SJ75、pCold TF::FIP-glu、pCold TF::FIP-fve、pCold TF::FIP-vvo原核表达载体。通过IPTG诱导在大肠杆菌（Escherichia coli）Rosetta细胞中高效表达了可溶性的重组FIP-SJ75（rFIP-SJ75）、rFIP-glu、rFIP-fve、rFIP-vvo;分别使用SDS-PAGE和Western Blot对rFIPs进行确认;通过Bradford法测定rFIPs的产量。结果显示,上述rFIPs能够正确地在大肠杆菌中表达,产量分别为17.69 mg/L、15.37 mg/L、13.42mg/L、11.88 mg/L。使用凝血酶切除His标签和Trigger Factor分子伴侣后,利用纳升液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱联用仪对纯化后的rFIP-SJ75进行鉴定。结果显示,检测得到的6个肽段拼接后与预测的FIP-SJ75的氨基酸序列匹配率为84.3%,说明表达和纯化后得到的分子量为13 k D左右的重组蛋白就是预期的rFIP-SJ75。为了进一步探究和比较rFIP-SJ75与其他三个亲本rFIPs的直接抗肿瘤活性和免疫调节活性,以人类肝癌细胞HepG2和小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为材料,进行体外生物活性实验。HepG2肝癌细胞的CCK-8细胞毒性实验显示,rFIP-SJ75对HepG2细胞的细胞毒性具有剂量依赖性,当8μg/mL的rFIP-SJ75处理细胞后,细胞毒性达到稳定。四种rFIPs细胞毒性比较结果显示,当蛋白浓度为32μg/mL时,r FIP-SJ75对HepG2增殖的抑制效果显著强于rFIP-vvo。RAW264.7巨噬细胞的CCK-8细胞毒性实验结果显示,在低浓度范围（1～8μg/m L）内,rFIP-SJ75能够显著促进RAW264.7细胞的增殖。中性红摄入实验探究rFIPs对RAW264.7细胞吞噬效果的结果显示,在1～16μg/mL浓度范围内,rFIP-SJ75对RAW264.7细胞吞噬能力的增强效果具有剂量依赖性。当用8μg/mL的rFIPs处理细胞时,四种rFIPs都能显著增强巨噬细胞的吞噬作用,并且rFIP-SJ75对巨噬细胞的吞噬能力的增强效果优于rFIP-glu和rFIP-fve。最后,采用实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcriptase real-time PCR,RT-qPCR）技术探究rFIPs对巨噬细胞炎症相关基因表达的影响。结果显示,用四种rFIPs处理RAW264.7细胞6 h后,8μg/mL的rFIPs能够促进2种促炎相关基因（TNF-α和IL-6）的表达,抑制2种抗炎相关基因（IL-10和TGF-β1）的表达。在四种r FIPs之间,对于促炎相关基因,rFIP-SJ75对TNF-α表达的促进效果弱于rFIP-fve;对IL-6表达的促进效果强于r FIP-glu和rFIP-vvo。对于抗炎相关基因,rFIP-SJ75对IL-10表达的抑制效果强于rFIP-fve和rFIP-vvo;rFIP-SJ75对TGF-β1的抑制效果强于rFIP-vvo。总之,新型属间重组真菌免疫调节蛋白rFIP-SJ75能够成功地在大肠杆菌中表达。在一定浓度范围内,rFIP-SJ75对人类肝癌细胞HepG2具有显著的直接抗肿瘤作用。在一定浓度范围内,rFIP-SJ75能够显著促进小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7的增殖,增强RAW264.7细胞的吞噬能力,促进促炎相关基因的表达和抑制抗炎相关基因的表达。本研究为之后关于FIP-SJ75作为一些炎症相关疾病的免疫调节剂的研究和工业化生产提供了理论基础。