基于交配型基因的蛹虫草单孢菌株分离与杂交育种研究

作     者：李小凤 

作者单位：北京农学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张国庆;邹亚杰

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：蛹虫草 退化 交配型基因 单孢杂交育种 虫草素 

摘      要：蛹虫草(Cordyceps militaris)是一种食药用菌,菌种退化导致蛹虫草子实体产量降低、活力下降,是制约蛹虫草栽培的最突出问题之一。蛹虫草是异宗配合真菌,存在两类不同源的交配型MAT1-1和MAT1-2。本研究以采集并分离的蛹虫草子实体为材料,开展菌株分离与交配型鉴定、单孢分离与鉴定、菌丝培养条件比较、基于交配型基因继代培养退化、单孢杂交育种实验、杂交子代交配型基因表达分析、虫草素关键酶基因克隆与表达分析等研究,为选育性状优良、遗传稳定的蛹虫草菌株提供理论依据,具体内容如下:1.经形态与ITS鉴定,确定CM1901、YNCC04菌株为蛹虫草。经交配型基因鉴定,CM1901菌株为含有MAT1-1、MAT1-2的双交配型菌株,YNCC04菌株为仅含有MAT1-1的单交配型菌株。2.以蛹虫草CM1901菌株为材料,获得了102株子囊孢子单孢菌株。测定单孢菌株交配型基因,结果显示子囊孢子菌株交配型存在3种类型,包括仅含MAT1-1、仅含MAT1-2的单交配型和同时含有MAT1-1和MAT1-2的亲本型,数量分别为57、24和21株,MAT1-1:MAT1-2为78:45。基于单因素培养条件实验,亲本菌株与不同交配型单孢菌株表现出了不同营养需求。3.基于q PCR的继代培养退化研究结果表明,MAT1-1在仅含MAT1-1、亲本型单孢菌株和亲本菌株中表达均相对稳定;MAT1-2仅在MAT1-2单孢菌株中表达相对稳定,而在亲本型单孢菌株和亲本菌株中,随继代培养的进行,表达量迅速下降直至缺失。4.利用性状优良的单交配型菌株各3株、两两杂交(共9组),3种单孢型菌株各3个及亲本(共10组)为对照组,进行蛹虫草杂交出菇实验。结果显示:CM1901亲本可以在培养基中产生带有成熟子囊壳的子实体,但其鲜重为5.77 g/瓶,表现出菌株退化现象。在9个杂交组合中,7个出草,出草率为78%,优秀率为100%,产量范围在6.37-18.00 g/瓶;其中仅含MAT1-1的CMSS02菌株参与的杂交组合平均产量最高,为14.79 g/瓶,是亲本菌株的2.5倍;仅含MAT1-2的CMSS30菌株参与的杂交组合(除CMSS102×CMSS30)平均产量最高,为15.10 g/瓶,是亲本菌株的2.6倍。在9株单孢菌株中,出菇率为66.6%,优秀率为11.1%,产量范围在5.23-18.00 g/瓶;其中CMSS30产量最高,为19.17 g/瓶,是亲本菌株的3.3倍,有子囊壳,但子实体颜色发白,直径较细;其次是CMSS07,为17.23 g/瓶,是亲本菌株的2.9倍,但无成熟的子囊壳。综合各性状说明,基因不同交配型的单孢杂交可以提高蛹虫草子实体的性状和产量。5.子实体交配型基因表达结果显示,与继代培养的菌丝体相比较,交配型基因表达有明显的的差异,MAT1-1相对表达较低,MAT1-2相对于MAT1-1表达量较高。6.腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(AMI)、IMP脱氢酶(Imp)、GMP合成酶(Gmp)报道是虫草素合成关键酶基因。q PCR结果表明,AMI、IMP都有较高的相对表达量,Gmp在各菌株中低表达。