姜黄素对高糖无血清环境下BMSCs的保护作用及促创面愈合效应机制研究

作     者：唐雪 

作者单位：西南医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李晓鲁

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：骨髓间充干细胞 高糖环境 姜黄素 创面愈合 生物学活性 

摘      要：目的:近年来,糖尿病发病率急剧上升,由于长期血糖控制不佳,所致血管生成和血流灌注障碍,导致足部缺血性溃疡和坏疽的发生,形成慢性创面,为治疗带来了挑战。随着生物技术地不断发展,干细胞移植成为治疗下肢缺血性疾病、糖尿病创面新途径,为治疗带来了希望。因此本研究以糖尿病创面局部微环境改变为切入点,通过体外建立高糖无血清环境,从而模拟糖尿病患者体内高糖缺血的状态,在高糖无血清环境下,初步探讨姜黄素对骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的影响。首先,我们通过在高糖无血清的环境下培养BMSCs,初步验证姜黄素对BMSCs的凋亡率、抗氧化能力的影响。其次,在体外细胞高糖无血清环境下,进一步研究姜黄素对BMSCs旁分泌、迁移能力的影响并初步探讨其作用机制。方法:(1)从Sprague-Dawley(SD)大鼠提取出BMSCs,体外传代培养,细胞培养到第三代(Passage3,P3)时,使用流式细胞仪对其进行表面分子抗原鉴定,成脂、成骨诱导染色,检测细胞分化潜能。(2)取生长状态良好的第三代至第四代BMSCs,培养过夜后,使用CCK8法考察姜黄素对骨髓间充质干细胞存活率的影响,通过此步确定姜黄素安全浓度,用于后续实验。姜黄素安全药物浓度确定后,取第三代BMSCs,通过在高糖无血清环境下培养BMSCs48h,模拟糖尿病创面高糖缺血环境,实验按照以下条件分为5组,分别为空白对照组、模型对照组、以及不同浓度(0、1、5、10μmol/L)姜黄素药物组,空白对照组BMSCs培养条件为含5.5mM葡萄糖,10%血清浓度的DMEM/F12培养基,药物组与高糖无血清模型组一致,均在33mM葡萄糖,无血清的DMEM/F12培养基中培养;48h后,观察BMSCs形态学变化,检测各组细胞凋亡水平和细胞内活性氧(ROS)含量;使用ELISA法检测高糖无血清环境下各组细胞氧化应激指标超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)的表达。(3)按上述相同实验分组,将细胞培养48h后,对BMSCs进行划痕,比较空白对照组、模型对照组、药物组中各组细胞在0h、24h细胞相对迁移率;采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase chain reaction,q PCR检测各组细胞旁分泌因子:细胞转化生长因子(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、血小板生长因子(PDGF)的m RNA表达水平,通过蛋白印迹(Western blot,WB)检测各组细胞基质金属蛋白酶(MMP2)蛋白表达情况。结果:(1)提取的大鼠BMSCs细胞呈梭形和纤维状生长,流式细胞仪检测BMSCs表面标志物CD90、CD29呈阳性,CD45呈阴性,细胞具有成骨成脂多向分化潜力。(2)由CCK8结果可以得出,姜黄素在20μmol/L以下,对细胞增殖作用无明显毒性作用(P0.05);与模型对照组相比,显微镜下可见姜黄素10μmol/L组BMSCs漂浮细胞减少,细胞形态改善;流式检测结果表明,高糖无血清环境细胞凋亡率增加(P0.05),5、10μmol/L组,细胞内荧光亮度均降低(P0.01),不同浓度梯度姜黄素药物作用后,与模型对照组相比,当姜黄素浓度为10μmol/L时,细胞内ROS降低具有显著性差异(P0.01);氧化应激指标检测显示,与空白对照组相比,高糖无血清环境下,细胞内SOD表达下降(P0.01),CAT表达下降(P0.05),MDA含量增加(P0.01);与模型对照相比,给予不同浓度姜黄素后,细胞内SOD表达上升,以姜黄素浓度为5、10μmol/L具有统计学差异(P0.05);细胞内CAT表达增加,以姜黄素浓度在10μmol/L具有统计学差异(P0.05);细胞内MDA含量下降,姜黄素浓度为5μmol/L具有统计学差异(P