PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因在84K杨中的共同遗传转化研究

作     者：刘慧新 

作者单位：东北林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨传平;曲冠证

授予年度：2021年

学科分类：0907[农学-林学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 

主      题：84K杨 PtrCAld5H2 PtrCOMT2 双价载体 生物信息学分析 

摘      要：木质素是植物体内广泛存在的大分子物质,在植物适应外界的环境过程中也发挥作用。木质素由 H 型(p-coumaryl alcohol),G 型(Coniferyl alcohol),S 型(Sinapyl alcohol)三种不同的木质素单体通过不同比例组成。不同种植物之间木质素单体比例不同导致木质素理化性质不同限制了木材的应用,因此改变木质素含量的策略具有重要意义。本文主要通过从毛果杨中克隆获得的PtrCAld5H2和PtrCOMT2两个基因,利用生物信息学软件,对两个基因的功能进行分析和预测,构建双价表达载体并稳定转化到84K杨中,进一步探究PtrCAl5H2和PtrCOMT2两个基因对S型木质素,木质素单体比例及木质素含量的影响。主要研究结果如下:(1)PtrCAld5H2基因的cDNA长度为1545 bp,共编码514个氨基酸。GenBank登录号为EU603311。PtrCAld5H2基因蛋白分子式C2625H4132N704O744S32,为亲水性稳定蛋白。PtrCOMT2基因的cDNA长度为1095 bp,共编码364个氨基酸。GenBank登录号为EU603317。PtrCOMT2基因蛋白分子式为C1784H2800N452O524S24。为不稳定疏水性蛋白。对PtrCOMT2蛋白的保守结构域进行预测,结果表明,保守区包含从35位至85位的氨基酸,该基因属于dimer ization2 superfamily家族,包含dimer ization保守结构域。保守区包含从140位至345位的氨基酸,该基因属于AdoMetTases superfamily家族,包含Methyltransf2保守结构域。(2)成功构建过表达载体,利用农杆菌介导法转化84K杨后获得了11个转基因株系。DNA和RNA水平检测结果均表明,PtrCA ld5H2和PtrCOMT2基因已经成功整合到了 84K杨中;实时荧光定量PCR检测结果显示,以PtrCAld5H2和PtrCOMT2基因相对表达量最低的84K杨转基因株系L7为参考,PtrCAld5H2基因相对表达量在L8、L9、L10转基因株系中较高,分别是L1的16倍,21.7倍和25.9倍;PtrCOMT2基因相表达量在L8,L10和L9相对表达量较高,分别为L7的4.4倍、7倍和7.7倍。(3)转基因84K杨,与野生型WT相比木质素含量均无显著变化。(4)将过表达PtrCA ld5H2和PtrCOMT2过表达转基因株系L8,L9和L10及野生型84K杨的茎段通过HPLC方法进行木质素单体含量的检测与分析,结果发现在转基因株系与野生型中S型木质素单体和G型木质素单体含量有变化,但是S型木质素与G型木质素的比值与WT相比差异不大。