单细胞分析研究理化因子对球形赖氨酸芽孢杆菌芽孢及其萌发的影响

作     者：李翠梅 

作者单位：广西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘军贤;王桂文

授予年度：2021年

学科分类：090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：球形赖氨酸芽孢杆菌 单细胞分析 理化因子 芽孢萌发 异质性 

摘      要：球形赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus(Ls)是应用广泛的杀幼蚊制剂。Ls不仅能在自然环境繁殖,而且也能在蚊子幼虫肠道繁殖。Ls制剂在施用的过程中会遇到各种生物与非生物因子,这些因子影响Ls制剂的杀幼蚊活性,也影响Ls细胞的存活。因此,分析理化因子对球形赖氨酸芽孢杆菌芽孢与芽孢萌发的影响,可为提高生物制剂的杀蚊效果提供理论参考。已有的研究表明,细菌芽孢萌发高度异质性,常规的群体分析方法无法揭示单个芽孢的行为。芽孢萌发作为芽孢从休眠态向营养生长转变的关键起始,也是杀灭芽孢类细菌的关键点,目前对Ls芽孢的萌发规律机制的认识有限,相关蛋白质在芽孢萌发中的作用机制尚不清楚。因此,本研究通过应用单细胞激光光镊拉曼光谱、DIC显微成像分析技术两种单细胞分析方法,分析物理因子紫外辐射、湿热或者化学药剂二氧化氯、戊二醛处理后单个Ls芽孢及其萌发过程,探究上述因子对Ls芽孢结构和成分的影响及对参与芽孢萌发的相关蛋白或者结构的影响;同时,分析了Ls菌株内和菌株间芽孢萌发的异质性和造成异质性的机理。本研究的主要内容有以下几个方面:(1)紫外辐射对Ls芽孢及芽孢萌发的影响。实时监测了紫外辐射2～10 min后单个Ls芽孢的结构成分变化及萌发的过程,分析处理后芽孢内物质结构成分的信息和芽孢在营养和非营养萌发下的萌发动态,获知Ca DPA释放过程的萌发参数(T、?T、?T等)。结果表明,紫外线处理使Ca DPA泄漏、蛋白质变性、芽孢萌发所需的蛋白质受损。受损最严重的是芽孢外膜上的皮层水解酶,其次Spo VA通道及相关蛋白,最后是芽孢内膜上的受体蛋白。(2)湿热处理对Ls芽孢及芽孢萌发的影响。单个Ls芽孢经过不同程度的湿热处理(90℃或95℃分别处理30、60 min或者100℃处理10 min),采集其拉曼光谱且用DIC显微成像观察芽孢在营养和非营养下的萌发,分析造成芽孢萌发动态曲线改变的原因,从而了解湿热处理对参与芽孢萌发的主要蛋白损伤情况及其对芽孢萌发的影响。结果显示,湿热处理不仅破坏芽孢的内膜造成孢内大量Ca DPA外泄,而且改变蛋白质的结构,并损害了芽孢萌发的相关蛋白,受损最显著的是受体蛋白,对Ca DPA释放通道蛋白和皮层水解酶影响较小。(3)二氧化氯对Ls芽孢的作用机制分析。二氧化氯(ClO)是高效杀菌剂,通过单细胞分析方法分析0.05%～0.3%ClO处理5 min后单个Ls芽孢内Ca DPA、蛋白质含量动态变化及其芽孢萌发过程孢内蛋白质物质变化动态,探究ClO对芽孢结构和萌发相关蛋白的影响。利用平板计数法统计处理后芽孢的存活率,拉曼光谱分析处理后芽孢内成分的变化,DIC监测处理后芽孢萌发过程所需蛋白质的作用机制。实验发现,ClO处理没有破坏芽孢内膜而孢内Ca DPA泄露,且ClO亚致死处理使芽孢萌发的相关蛋白失去功能,特别容易致芽孢皮层水解酶失活。(4)戊二醛处理对Ls芽孢及芽孢萌发的影响。戊二醛是继甲醛和环氧乙烷之后非常重要的化学消毒剂,具有高效低毒、使用范围广、性能稳定等特点。运用基于光学新技术的单细胞分析方法,了解戊二醛对Ls芽孢结构、成分及参与芽孢萌发的相关蛋白或者结构的影响,以期获知营养和非营养萌发剂与受体蛋白、Ca DPA释放所需蛋白以及皮层水解酶之间的关系。结果显示,戊二醛没有影响芽孢内部,也不造成Ca DPA、蛋白质泄漏,但严重影响了芽孢的萌发,损伤了参与芽孢萌发过程的各类蛋白。(5)Ls菌株间芽孢及芽孢萌发的异质性分析。利用拉曼光谱分析孢内CaDPA和蛋白质差异情况,DIC分析在不同萌发剂下芽孢萌发的异质性,透过萌发曲线和萌发动态参数T、T、T、I、I分析造成芽孢异质性原因。结果表明,Ls菌株内单个芽孢萌发有异质性,菌株间芽孢萌发也有异质性;同萌发剂在不同菌株中芽孢萌发过程不一致,同菌株在不同萌发剂中芽孢萌发过程也不一致。菌株间芽孢内Ca DPA和蛋白质含量有差异,但芽孢内的受体蛋白的数量、通道蛋白、皮层水解酶都可能是造成芽孢萌发异质性的主要原因。