肠毒素P基因SEP在大肠杆菌中的表达、蛋白纯化与鸡抗体制备

作     者：Walaa Abduljalil Ali Salam Al-Mathagi 

作者单位：兰州理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马建忠

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：金黄色葡萄球菌 肠毒素P 基因重组 蛋白表达 Ni-NTA亲和层系 鸡卵黄抗体 

摘      要：金黄色葡萄球菌肠毒素(SEs)是金黄色葡萄球菌在生长的对数期或从指数期向稳定期过渡期间合成的有效胃肠外毒素。金黄色葡萄球菌可产生多种胃肠毒素,包括金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P等多种肠毒素。金黄色葡萄球菌肠毒素P(SEP)是导致食物中毒的主要因素之一。食物尤其是肉制品和乳制品可因处理不当或在高温下储存而被金黄色葡萄球菌污染。SEP中毒症状发病迅速,病人恶心和剧烈呕吐,伴有或不伴有腹泻。鉴于SEP检测在食品安全方面的重要性,本研究亚克隆了SEP基因至大肠杆菌表达载体、表达、纯化、免疫产蛋鸡并制备了鸡卵黄抗体。以期建立基于免疫学方法检测SEP的相关试剂。本论文的主要研究成果如下:(1)以pUC18-SEP为模板DNA,以Primer F(含EcoRI位点)和Primer R(含SalI位点)为引物扩增了SEP基因。扩增产物经EcoRI和SalI酶切、琼脂糖凝胶电泳分离、回收后与相应限制性内切酶处理的pET28a载体连接,获得pET28a-SEP重组载体。经核苷酸序列分析,亚克隆的SEP基因序列与模板和NCBI数据库中的SEP序列一致。(2)含重组质粒pET28a-SEP的大肠杆菌(*** Rossita)活化后在37℃、220rpm下培养至OD≥0.6,之后在16℃、220rpm下以1mmol/L IPTG诱导过夜。离心收集菌体,超声破碎后进行SDS-PAGE分析。结果表明,SEP蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于菌体破碎后的上清中,沉淀中仅有少量SEP蛋白。(3)以商品化SEP抗体检测上述大肠杆菌诱导表达后的蛋白,发现诱导表达量最大的蛋白带(32.6k Da)呈阳性。其与含有标签肽(6x His-Thrombin-T7 Tag)的SEP蛋白的理论分子量(29.77k Da)基本一致。(4)上述细胞裂解液上清以Ni-NTA亲和层析法进行了纯化。纯化后的样品进行SDS-PAGE分析,显示分子量在32.6k Da的蛋白被纯化保留。(5)根据SDS-PAGE结果,Ni-NTA纯化的重组SEP蛋白中仍然存在一些微量的杂蛋白。据此,我们以Sephadex G-100进行了进一步纯化,随后以50%的饱和硫酸铵进行了选择性沉淀,进一步提高了重组蛋白SEP的纯度。(6)经Ni-NTA亲和层析纯化后,从SDS-PAGE凝胶中切下分子量为32.6k Da蛋白的条带做串联质谱鉴定。串联质谱共测得8条肽段的氨基酸残基序列,均与重组SEP蛋白的序列一致。(7)每毫克纯化的重组SEP蛋白与完全弗氏佐剂混合后免疫产蛋鸡三次,每次间隔15天。Dot Blotting分析初步表明,在第二次注射抗原后,IgY活性最高。