犬瘟热病毒对人SLAM受体适应机制及其在人SLAM转基因小鼠体内复制的研究

作     者：冉伟 

作者单位：黑龙江八一农垦大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙东波

授予年度：2021年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：犬瘟热病毒 跨宿主传播 信号淋巴细胞激活分子 转基因小鼠 致病性 

摘      要：犬瘟热(Canine distemper,CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种多种动物共患传染病。信号淋巴细胞激活分子(Signalling lymphocyte activation molecular,SLAM)为CDV等麻疹病毒属成员感染宿主的主要受体,其在病毒跨种间传播及宿主致病性中起到重要作用。CDV H蛋白在识别病毒SLAM受体,介导病毒入侵和调节病毒毒力中发挥重要作用。近年来,随着生态环境变化和病毒变异,CDV自然宿主已由犬科、猫科和浣熊科等动物扩大到灵长目的猕猴。因此,CDV能否通过人SLAM受体突破物种屏障而传播给人类的科学问题值得我们关注。我们在前期克隆得到CDV人SLAM(hSLAM)受体适应株5804Pe/H-VHS基础上,证实CDV-H蛋白D540G氨基酸突变可介导病毒对表达hSLAM受体的Vero细胞(Vero-hSLAM)有效感染。本研究中,我们进一步通过hSLAM受体阻断试验、H/hSLAM互作三维模型、免疫印迹、H/hSLAM免疫共沉淀、人PBMC体外感染和血清抗体交叉中和保护实验等技术,研究了5804Pe/H-VHS株适应hSLAM受体的分子机制。实验结果表明:(1)D540G突变未改变CDV H蛋白在细胞膜上的表达量(p0.05);(2)抗hSLAM单克隆抗体可显著阻断CDV对Vero-hSLAM细胞的感染(p0.05);(5)5804Pe/H-VHS株能在体外有效感染人PBMC(病毒载量可达10TCID/mL)(p0.01),且可明显抑制PBMC的增殖活性(p0.05);(6)CDV疫苗免疫血清可对5804Pe/H-VHS株产生交叉免疫作用(p0.01)。为进一步明确病毒在体内致病性,本研究分别以5804Pe/H-VHS和5804Pe/H株(10TCID)鼻腔感染hSLAM转基因小鼠hSLAM(+/+))/STAT1(-/-))。感染后7天,将小鼠麻醉后进行剖检观察。分别应用RT-PCR和Vero-hSLAM细胞检测组织中病毒载量,通过激光共聚焦技术研究组织中病毒与hSLAM受体共定位情况。上述结果显示,(1)与5804Pe/H感染组相比,5804Pe/H-VHS感染组脾脏显著肿大、增重(p0.01);(2)5804Pe/H-VHS感染组中,CDV RNA在脾脏、肺脏中呈强阳性,在淋巴结、胸腺和肾脏呈弱阳性,脑呈阴性,而5804Pe/H感染组,除胸腺呈弱阳性外,其余组织均为阴性;(3)5804Pe/H-VHS感染组在免疫细胞和器官(PBMC、脾脏、淋巴结、胸腺)和上皮组组中病毒载量均显著高于5804Pe/H感染组(p0.01);(4)5804Pe/H-VHS感染组脾脏、肺脏和淋巴结中病毒与hSLAM发生共定位,而5804Pe/H感染组中未观察到病毒e GFP荧光。综上,CDV 5804Pe/H-VHS株能体外有效感染人PBMC,并可抑制其细胞增殖活性;病毒感染hSLAM转基因小鼠后,可在其免疫器官和上皮组织中复制。本研究初步揭示了CDV适应hSLAM受体的分子机制,建立了CDV感染小鼠的致病模型,为进一步评估CDV跨种间感染人类的风险提供了研究基础。