6-姜酚在新生小鼠缺氧缺血性脑损伤中的作用及机制研究

作     者：赵曼 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郝爱军

授予年度：2021年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：6-姜酚 HIE 细胞凋亡 神经炎症 少突胶质细胞 

摘      要：研究背景新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy HIE）是指由脑部缺氧缺血造成的脑部损伤,是新生儿死亡和致残的主要原因,幸存者多出现智力发育迟缓和运动功能障碍等神经系统后遗症。目前,除亚低温治疗外,尚无特异的有效治疗方法,临床多采用支持对症治疗,其目的为阻断缺氧缺血原发损伤及减轻或避免继发性脑损伤,主要包括维持适当的通气和氧合,维持适当的脑血流灌注,维持适当血糖水平,适量限制液体入量,预防脑水肿等,以上措施为HIE的非特异性基础治疗且治疗效果欠佳。因此,探寻新的有效治疗方法至关重要。HIE会导致一系列的病理生理变化包括神经细胞凋亡和坏死,小胶质细胞激活,兴奋性毒性,氧化应激和线粒体功能障碍等等,同时,作为大脑常驻免疫细胞的小胶质细胞活化后会释放促炎介质,造成神经细胞的继发性死亡甚至髓鞘损伤,而髓鞘损伤是白质损伤的主要病理变化,且白质损伤与患儿长期运动和认知障碍密切相关。因此,减轻HIE后炎症反应,促进神经细胞存活并减轻髓鞘损伤对HIE后脑损伤的恢复具有重要意义。目前,传统中药在疾病应用中日益广泛。生姜作为一种传统中药,具有解表散寒,温中止呕,温肺止咳的功效,在临床上应用广泛。已有多种研究表明其在心血管系统疾病、消化系统疾病及中枢神经系统疾病等方面均有一定治疗作用。6-姜酚（6-gingerol）是一种生姜提取物,是生姜发挥药理活性的最主要成分之一,在新鲜生姜根茎中可大量获得。研究证实,其具有低毒性,可通过血脑屏障,具有广泛的药理活性,在抗肿瘤、抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡等方面发挥重要作用。然而,其在治疗新生儿HIE中的作用和分子机制需要进一步研究。研究目的:探究6-姜酚能否减轻小鼠HIE后脑损伤进而改善HIE后神经行为障碍并探讨其作用机制,为HIE的临床治疗提供新的有效方法。研究方法1.HIE造模选择7日龄昆明幼仔作为实验对象,采用Rice-Vannucci造模方法。实验组（HIE组）小鼠麻醉后仰卧位固定,切皮后剥离右侧颈总动脉进行血管结扎,结扎后小鼠回窝休息1h,然后小鼠置于含5%二氧化碳、9%氧气、86%氮气的37℃低氧培养箱中进行90min缺氧。假手术组（Sham组）仅剥离右侧颈总动脉,不结扎血管也不进行缺氧处理。2.实验分组将7日龄昆明幼仔随机分成三组:Sham组、HIE组和HIE+6-姜酚组（HIE+6G组）,HIE造模前24h通过腹腔注射6-姜酚,同时在HIE造模后1d、2d和3d分别进行6-姜酚注射。Sham组和HIE组注射相应体积的无菌生理盐水。3.检测方法3.1脑组织形态检测采用TTC（2,3,5-三苯基四唑氯）染色法检测小鼠脑缺血损伤面积。分别用 HE 染色、Nissl 染色、TUNEL 染色、IL-1β Iba-1、TNF-α Iba-1、MBP、PDGFRαOlig2、APC Olig2、active Caspase3 Olig2免疫荧光染色和LFB染色检测6-姜酚对HIE后脑损伤、神经细胞凋亡、小胶质细胞激活、髓鞘碱性蛋白（MBP）表达、少突胶质细胞分化和凋亡及髓鞘损伤的影响。通过测量脑重检测小鼠长期脑萎缩情况。3.2脑组织分子水平检测Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved PARP I,炎症因子IL-1β和TNF-α,MBP,组蛋白和炎症相关信号通路蛋白的表达。qPCR检测炎症因子IL-1β和TNF-α的表达。3.3小鼠行为学检测采用负趋地性反射实验、翻正反射实验和后肢悬吊实验评估小鼠短期神经反射和运动能力。通过旋转棒实验和开放旷场实验评估小鼠长期运动功能。研究结果一、6-姜酚减轻HIE后脑缺血和脑组织形态学损伤分别选用不同浓度6-姜酚（1 mg/kg、2 mg/kg和4 mg/kg）进行实验。TTC染色结果显示,2 mg/kg和4 mg/kg 6-姜酚均能减少脑缺血面积（P0.05）,但两者无显著差异。因此,选择2mg/kg 6-姜酚作为标准浓度。HE染色结果显示,HIE后小鼠大脑皮层和海马出现明显的细胞水肿和坏死。药物治疗后水肿、坏死程度明显减轻。二、6-姜酚可改善HIE后小鼠短期神经反射小鼠行为学结果显示,HIE组小鼠表现为负趋地性反射时间和翻正反射时间增加（分别为P0.001,P0.0001）,治疗组小鼠反射时间分别较HIE组小鼠缩短（分别为P0.05,P0.01）。在后肢悬吊实验中,HIE组悬吊时间略短于Sham组（P0.0001）,而6-姜酚治疗组悬吊时间较HIE组有所增加（P0.01）。三、6-姜酚减轻HIE后神经细胞凋亡并调控凋亡相关蛋白的表达尼氏染色结果显示,HIE后皮层和海马区细胞水肿、坏死、尼氏体减少明显,6-姜酚治疗可降低损伤程度。同时,利用TUNEL免疫荧光染色进一步评估细胞凋亡,结果显示HIE后小鼠患侧皮层TUNEL阳性（TUNEL+）细胞数量增加（P0.0001）,而6-姜酚可减少HIE后小鼠TUNEL+细胞数量（P0.01）。此外,Western Blot结果显示,6-姜酚治疗后Bcl-2/Bax比值升高（P0.01）,Cleaved PARPI蛋白表达降低（P0.01）,提示6-姜酚可通过抗细胞凋亡发挥神经保护作用。四、6-姜酚抑制HIE后炎症因子的表达并减轻小胶质细胞的激活qPCR和Western Blot结果显示,药物治疗后炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA和蛋白表达水平明显降低（分别为P0.001,P0.0001,P0.0I,P0.05）。免疫荧光染色结果显示,药物治疗后激活的小胶质细胞（IL-1β Iba-1阳性和TNF-αIba-1阳性）数量明显减少（分别为P0.01,P0.0001）,表明6-姜酚可显著抑制HIE后炎症因子的表达和小胶质细胞的激活。五、6-姜酚改善HIE诱导的脑萎缩HIE后4周进行脑重称量。结果显示,HIE组小鼠脑重量下降明显（P0.0001）,且损伤侧出现严重脑萎缩;而6-姜酚治疗组小鼠脑重增加（P0.05）且损伤侧脑萎缩程度减轻。HE染色结果同样显示其可减轻HIE后脑萎缩。六、6-姜酚可改善HIE后长期运动功能障碍通过旋转棒测试和开放旷场实验对小鼠的运动能力进行评估。HIE会导致小鼠运动距离明显降低（P0.0001）,药物治疗后可提高其运动能力（分别为P0.01,P0.001）。七、6-姜酚可挽救HIE诱导的髓鞘损伤LFB染色和MBP免疫荧光染色显示6-姜酚可减少HIE后髓鞘丢失。Western Blot结果显示,与HIE组相比,用药后MBP蛋白表达升高（P0.05）。八、6-姜酚促进HIE后少突胶质细胞的成熟并减少少突胶质细胞的凋亡免疫荧光染色结果显示,HIE后,小鼠患侧胼胝体少突胶质祖细胞（PDGFR-α+Olig2+）数量增加（P0.001）,成熟的少突胶质细胞（APC+Olig2+）数量减少（P0.0001）;6-姜酚治疗可减少少突胶质祖细胞数量并增加成熟少突胶质细胞的数量（分别为P0.001,P0.05）,促进少突胶质细胞的成熟。同时,与对照组相比,HIE组患侧胼胝体active Caspase3+Olig2+细胞数量明显增加（P0.0001）,6-姜酚组双阳性细胞数量明显减少（P0.001）。九、6-姜酚可调控Akt、ERK和NF-κB信号通路发挥神经保护作用Western Blot显示,HIE组患侧皮层p-Akt表达水平降低（P0.01）,6-姜酚治疗后,Akt磷酸化水平升高（P0.05）。此外,HIE后ERK和NF-κB分子磷酸化水平升高（P0.01）,6-姜酚可以逆转这一变化（分别为P0.01,P0.05）。十、6-姜酚可调节组蛋白表观遗传修饰Western Blot显示,HIE后72h患侧皮层组蛋白乙酰化表达水平降低（P0.01）,然而,6-姜酚对组蛋白总体乙酰化水平无明显作用。同时,结果显示,HIE后72h患侧皮层H3K4和H3K9的三甲基化水平变化不明显,H3K27三甲基化水平升高（P0.05）而6-姜酚可降低HIE后H3K27三甲基化水平（P0.05）。研究结论6-姜酚通过减少神经细胞凋亡,抑制炎症因子释放和小胶质细胞的激活,对HIE发挥神经保护作用。其能改善HIE后小鼠的短期行为反射和长期脑萎缩。并且,6-姜酚可促进少突胶质细胞成熟,减少少突胶质细胞凋亡,减轻髓鞘损伤,改善小鼠长期运动能力。此外,6-姜酚通过调控Akt、ERK、NF-κB信号通路和组蛋白H3K27三甲基化水平发挥保护作用。因此,6-姜酚可作为治疗HIE的新的候选药物。