来源于Arthrobotrys sp. CX1菌株的GH7家族纤维素内切酶克隆、表达及其酶学性质的研究

作     者：孟虹 

作者单位：大连工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李蓉

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：纤维素 纤维素内切酶 GH7 

摘      要：能源可持续发展是我国重要发展策略,而纤维素降解生产生物燃料乙醇更是研究热点。生物酶降解纤维素是目前最环保最有发展前景纤维素降解方法之一,其中纤维素内切酶在纤维素降解中扮演重要的角色,因此挖掘高效的纤维素内切酶进行纤维素绿色降解成为研究热点。糖苷水解酶7家族蛋白(glycoside hydrolase family7,GH7)是生物质降解真菌分泌基因组中最普遍的纤维素降解酶,主要在真菌中发现,具有强大的水解作用,因此GH7家族纤维素酶在工业生物量转化上处于重要地位。本实验前期从Arthrobotrys ***1的差异蛋白转录组数据中挖掘出两个GH7家族蛋白,分别命名为cx GH7A与cx GH7B。蛋白序列及结构域分析发现,cx GH7A与cx GH7B虽来源于同一宿主并且同时含有GH7家族蛋白催化结构域GH7-CBH-EG,但两者在进化上则有所不同。分别模拟cx GH7A和cx GH7B蛋白结构发现,两个蛋白均含有由多个loop区围绕反向平行的β-折叠形成的β-三明治结构所组成的GH7-CBH-EG结构域,但在活性中心以外的一些loop区以及表面区域的微小的区别。cx GH7A在活性中心外含有loop区,形成封闭的隧道状活性位点;cx GH7B缺少活性中心位点上的loop区,使催化中心成开放的裂缝区。理论分析表明这两种蛋白在功能性上可能存在差异性。之后分别对cx GH7A与cx GH7B蛋白进行重组构建及表达,构建重组质粒p PICZαA-cx GH7A、p PICZαA-cx GH7B导入到毕赤酵母X-33中,得到p PICZαA-cx GH7A/X-33、p PICZαA-cx GH7B/X-33并进行异源表达。将两个蛋白同时作用于不同底物,实验结果表明cx GH7A蛋白显示出纤维素外切酶活性,cx GH7B蛋白显示出纤维素内切酶活性,因此进行cx GH7B蛋白的相关酶学性质表征。实验结果如下:(1)cx GH7B蛋白在40℃、p H=6时显示出最高的酶活性;(2)cx GH7B蛋白在30℃-65℃以内可以保持80%以上的酶活性,具有广域的温度稳定性,并且在最适温度40℃下,具有高度稳定性;(3)cx GH7B蛋白在Ni等金属离子存在时,酶活升高至108%左右,在EDTA螯合剂存在下,酶活丧失,因此cx GH7B蛋白是依赖于金属离子存在的;(4)将cx GH7B作用CMC后反应液进行离子色谱产物分析,分别产生葡萄糖、二糖及寡糖,这也进一步说明了cx GH7B蛋白具有纤维素内切酶活。以上结果说明cxGH7B蛋白确实是GH7家族纤维素内切酶,并且在广域的温度下都保持着降解纤维素的能力。但是cx GH7A蛋白同时显示出降解纤维素的能力,为以后研究GH7家族纤维素外切酶作用机制研究提供了研究基础。