湖北地区种植的七叶一枝花内生细菌的多样性分析及促生菌筛选

作     者：甘喆 

作者单位：中南民族大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋发军;张鹏

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：七叶一枝花 内生细菌 多样性分析 重楼皂苷 促生菌 

摘      要：七叶一枝花（Paris polypholla）又名重楼,是历版药典予以收录的珍稀药用植物,市场需求量大。人工种植七叶一枝花为其市场的主要来源。然而,人工种植七叶一枝花存在抗病能力减弱、重楼皂苷含量降低等品质下降问题。本研究以采集自湖北代表性种植区的五年生七叶一枝花为对象,采用高通量测序技术和传统微生物培养方法,分别分析其根、茎、叶3种组织的总内生细菌和可培养内生细菌的多样性及其组成特征;通过HPLC法检测其根、茎、叶中的重楼皂苷含量,并分别与总内生细菌和可培养内生细菌菌群建立相关性,分析与其重楼皂苷合成呈显著正相关的优势菌群和功能菌群;进一步将相关优势菌群与小麦幼苗共培养,筛选促生菌株,为后期利用内生菌改良七叶一枝花繁育技术研究奠定基础。主要研究结果如下:1)采用Illumina Miseq高通量测序技术首次对湖北种植七叶一枝花根、茎、叶的总内生细菌进行分析。在97%的相似性水平下,将获得的334878条有效序列归为1129个OTU。总内生细菌归属到20个门,39个纲,96个目,181个科和340个属。根、茎、叶的总内生细菌中最优势菌属（属水平）分别为:贪铜菌属（Cupriavidus,20.57%）、贪铜菌属（29.93%）和红球菌属（Rhodococcus,25.63%）。总内生细菌的分布和组成在3种组织中存在差异性,根中总内生细菌的丰富度、多样性和均匀度高于茎、叶,且根和茎的总内生细菌组成更为相似。物种互作关联网络分析表明有250对（65.96%）内生细菌呈正相关,129对（34.03%）内生细菌呈负相关,且协作关系占多数。2)采用2种培养基从湖北种植七叶一枝花各0.1 g的根、茎、叶中分离得到1090株可培养内生细菌,其中927株可培养内生细菌的16S r DNA序列被扩增和分析,这些可培养内生细菌被归属到4个门、7个纲、17个目、26个科、50个属。根、茎、叶的可培养内生细菌中最优势菌群（属水平）分别为:芽孢杆菌属（Bacillus,44.49%）、假单胞菌属（Pseudomonas,21.22%）和不动杆菌属（Acinelobacter,47.17%）。3种组织中可培养内生细菌的分布和组成存在差异性:可培养内生细菌的分布数量在根（589株）中最多,其次为茎（331株）和叶（170株）;组成相似性由高到低为:根/茎（42.11%）茎/叶（22.64%）根/叶（16.67%）,其中,根和茎的可培养内生细菌组成相似性最高;根和茎中可培养内生细菌的多样性和菌群丰富度均高于叶。可培养内生细菌和总内生细菌在3种组织中的优势菌属不一致,但可培养内生细菌与总内生细菌的组织差异性分析结果基本一致。3)通过检测根、茎、叶中重楼皂苷I、II、VI、VII的含量,发现3种组织中均含有重楼皂苷VI、VII;重楼皂苷I（36.22 mg/g）、II（28.38 mg/g）和VI（0.99 mg/g）在根中的含量均为最多,重楼皂苷VII（6.51 mg/g）在叶中的含量最高。通过分析3种组织的总内生细菌和可培养内生细菌与其4种重楼皂苷含量的相关性,发现总内生细菌的OTU数、多样性指数与重楼皂苷呈显著正相关,可培养内生细菌的多样性和菌群丰富度与重楼皂苷呈显著正相关。并发现23个属的总内生细菌与4种重楼皂苷含量呈显著正相关,20个属的可培养内生细菌与4种重楼皂苷含量呈显著正相关。与重楼皂苷含量呈显著正相关的总内生细菌菌群中,共有19个属未在可培养内生细菌研究中分离得到。4)选择与4种重楼皂苷含量呈显著正相关的20个属的258株可培养内生细菌,分别与小麦幼苗进行共培养,初筛获得具有促生作用的可培养内生细菌56株,归类到14个属。并对促生作用最明显的HBR21038（农杆菌属）菌株进行复筛验证,发现HBR21038菌株对小麦幼苗的根长有显著的促进效果,与对照相比,共培养小麦的根长在第5、10、15、20天的增长率分别为:100%、126.09%、96.30%和46.51%;对小麦幼苗的株高也有显著的促进效果,与对照相比,共培养小麦的株高在第5、10、15、20天的增长率分别为:31.58%、37.07%、68.70%和10.45%。