两种芽胞杆菌对吗啉信号分子的差异性感知机制
作者单位：南阳师范学院
学位级别：硕士
导师姓名：牛秋红;黄小权
授予年度：2021年
主 题：杀线虫芽胞杆菌 枯草芽胞杆菌 吗啉信号 差异性感知 生物膜
摘 要：植物寄生线虫对全球经济造成巨大损失,生物防治因不会对环境造成污染,已成为当今世界各国大力推崇的防治方法。而生物防治植物寄生线虫最大的瓶颈是在田间不稳定、防效低等。对生防菌株侵染线虫分子机制的阐述可以为增强生防菌的防治效果提供理论依据。感知是细菌侵染线虫过程的第一步,决定着侵染的成败。细菌能够感知环境中的信号分子,调控自身基因的表达来适应环境。前期研究发现:从云南森林土壤中分离得到的一株对多种植物寄生线虫均具有较高杀灭活性的菌株杀线虫芽胞杆菌B16（Bacillus nematocida B16）,能够感知到线虫释放的吗啉信号,从而提前形成芽胞,芽胞可以保护B16抵抗线虫咀嚼和吞噬的伤害,进而在线虫的肠道成功定植,破坏线虫肠道,杀死线虫;而枯草芽胞杆菌168（*** 168）遇到线虫的时候不能感知到线虫的存在,最终被当作食物吃掉。可见,不同种类的芽胞杆菌对线虫有不同的反应调节分子机制。同为芽胞杆菌属,为何B16和168遇见线虫的时候会出现截然相反的结局?B16是如何感知线虫的?B16和168存在怎样的差异?基于以上问题,本研究以可感知线虫、提前形成芽胞的B16和不能感知线虫、不能提前形成芽胞的枯草芽胞杆菌168为研究对象,对比B16和168跨膜蛋白基因差异和细胞膜组分的差异;通过吸附亲和实验对比两种芽胞杆菌中吗啉结合膜蛋白的差异,寻找吗啉作用于B16的靶点膜蛋白,并利用分子模拟对接实验进行验证;对吗啉处理前、后两种芽胞杆菌的转录组差异进行对比分析,探索芽胞杆菌感知吗啉信号分子的相关基因,对分析获得的潜在感知相关基因进行q PCR验证;最后,发现B16感知吗啉后形成生物膜,进一步完善B16感知线虫形成芽胞的信号通路,从分子水平揭示两种芽胞杆菌对线虫吗啉信号的差异性感知,为植物寄生线虫的生物防治提供参考。本研究的主要结果有:1.B16和168膜蛋白的差异。通过对比B16和168的跨膜蛋白基因,发现跟168相比,B16存在117个独有的跨膜蛋白,其中亚细胞定位在Cell membrane上的有15个。此外,还分析到定位于非膜区的有5个,剩下97个蛋白未检测出亚细胞定位,其中2个没有检测到蛋白名称,其余都暂定为假想蛋白。以上结果说明,两种芽胞杆菌的蛋白组分有较大差异,尤其是跨膜蛋白基因存在较为显著的差异。2.B16和168膜组分的差异。B16和168的磷脂成分存在显著差异,占比差异大的成分有28个,B16独有成分20个,168独有成分11个。B16和168本身的脂肪酸成分就存在显著差异,每组数据在两种芽胞杆菌中的类型和数量均不同,且有四组数据存在着成倍数的差异,B16相较于168多了两种多碳链脂肪酸;B16在线虫诱导前后有三组数据都出现了占比明显增长的变化,而168在线虫诱导前后脂肪酸的类型和数量均没有发生变化。3.吗啉受体蛋白的差异。吸附亲和实验结果表明:B16与吗啉的结合度显著高于枯草芽胞杆菌168。经过强酸洗脱后,SDS-PAGE实验证实B16和168中吗啉受体蛋白有两个条带存在差异,这两个条带在B16中的含量明显要高于168。进一步用质谱分析,验证发现这两个条带的蛋白分别是肽结合蛋白S1和多肽ABC转运底物结合蛋白Opp A S2。定量分析表明B16的S1、S2蛋白含量均明显高于168,两种芽胞杆菌的氨基酸序列对比分析证实蛋白S1的氨基酸序列相似度为99.45%,S2相似度为96.80%。分子模拟结果显示B16的S1、S2膜蛋白与吗啉的对接能更接近吸附亲和,对吗啉的吸附个数也均多于168,结合S1、S2蛋白在B16和168膜蛋白中的含量差异,吗啉与B16的S1、S2蛋白亲和度远远高于168。4.两种芽胞杆菌感知吗啉信号后转录组差异分析。B16和168感知吗啉信号分子后在转录组学层面上存在着较大差异:其中与细胞膜、转运蛋白调控相关的差异基因共有16个,与调控芽胞形成相关的差异基因共有63个,与磷酸激酶相关的差异基因共有30个,其中仅有8个基因在吗啉诱导两种芽胞杆菌的同时间段内起着相同的调控作用,其中12 h的仅有2个基因;另外,tapA、tasA、epsI、epsF这四个与生物膜形成相关基因在吗啉诱导B16的12h均上调,促进了B16生物膜的形成。5.感知吗啉信号后生物膜形成的差异。B16感知吗啉后不仅调控自身基因,提前形成芽胞,而且还形成了生物膜。生物膜形成相关基因tasA、tapA、epsI、epsF进行qPCR验证,结果表明:B16感知吗啉信号12h后tasA、tapA、epsI、epsF这四个基因较之168的相对表达量大幅度上调,促进生物膜的形成。综上,B16和168虽同为芽胞杆菌属,但是在细胞膜组分上就存在较大差异,B16在面对线虫产生的吗啉信号时能够感知到吗啉,与膜上的靶点蛋白S1、S2进行吸附后,进入到
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